从人类诱导多能干细胞诱导的体外神经肌肉结点

1. 制备细胞外基质 （ECM）涂层板 将 ECM（参见 材料表）与冰冷 1x PBS 稀释至最终浓度为 2%。 在 50 mL 塑料管中将 1 mL 的 ECM 添加到 49 mL 的 1x PBS 中。通过上下多次移液，混合均好。 将 1 个盖玻片放入 6 井板的每个井中。在每个井中加入 1.5 mL 的 2% ECM。 在 37 °C 下用 2% ECM 孵育井板 2 小时。 从井板中吸出 ECM，并在使用前将板存放在 4°C。 2. iPSC 对 NMJ 的分化 种子 4 x 105 的 iPSC 每井在 6 井板准备在第 1 节。确保将预沉积在井中的盖玻片上的细胞播种。注：在这项研究中，201B7MYOD iPS细胞系，从樱井博士的实验室的礼物，使用了15。 从 6 厘米培养盘上的 iPSC 上取下介质，用 1x PBS 清洗 iPCs 一次。 将1 mL的细胞分离溶液加入到盘中，在37°C下孵育10分钟。 将3 mL的灵长类胚胎茎（ES）细胞培养素加入培养皿，轻轻移液器3次。 将包含分离的 iPSC 的上一代收集到 50 mL 塑料管中，并在 4 °C 下以 160 x g 的离心机进行 5 分钟。 小心吸上清液，用 10 μM Y27632 在 3 mL 灵长类 ES 细胞培养中重新暂停 iPSCs，并使用血细胞计计算细胞数。 使用灵长类 ES 细胞培养基和 10 μM Y27632 稀释 iPSC，浓度为 2 x 105 细胞 /mL。在第 1 节所述的井中预沉积的盖玻片上添加 2 mL 的 iPCC。 将 iPSC 感应到 NMJ 在第1天，24小时后，种子的 iPSCs 到6井板，删除培养基，并替换为2 mL的新鲜灵长类ES细胞介质含有1μg/mL多氧环素到每个井。 用含有1微克/mL多氧环素（最终浓度）的2 mL的介质（MDM）（表1）改变介质。每天刷新媒体从第2天到第10天。 从第11天开始，将NMJ介质的介质切换到2mL（表1）到每一个井。刷新介质每 3\u20124 天后，直到第 30 天。 在第 30 天通过相位倒置显微镜观察分化的 NMJ。NMJ 可用于以下分析。 3. 免疫荧光 （IF） 染色 第30天，从6井板块中吸出培养媒介。在室温下，将 2 mL 的 4% 半甲醛添加到每一个井中 30 分钟，从而修复 NMJ 培养物。 将 2 mL 的 1x PBS 添加到每个井中（每次洗涤 3 分钟），将样品洗净 3 次。 用0.1%的三顿/PBS对样品进行渗透，10分钟。 重复步骤 3.2。 在室温下用 0.5% BSA 将样品块住 1 小时。 重复步骤 3.2。 在4°C下用原抗体孵育样品过夜。抗体的稀释如下：岛1（1μg/mL），硫辛重链（MYH）（1/300），神经丝（NF）（1微克/mL），S-100 （1/300），突触囊泡蛋白2 （SV2） （1 μg/mL），Tuj1 （1/1000）。 重复步骤 3.2。 在室温下用二次抗体孵育样品1小时。使用的二级抗体浓度如下：抗小鼠IgG 488偶联（0.1μg/mL），抗兔IgG 488偶联（0.1微克/mL）。 重复步骤 3.2。 用 aBTX-647 （0.5 μg/mL） 孵育样品，用于 AChR 染色，用 DAPI（1 μg/mL）孵育样品，用于核染色。 重复步骤 3.2。 从 6 井板中拿起一对钳子，将其安装在显微镜幻灯片上 50% 甘油/PBS 溶液中。 4. 扫描电子显微镜 （SEM） 在室温下用0.1M磷酸钾缓冲液中准备4%的甲状甲醛和1%的谷胱甘肽修复NMJ培养物，使用1小时。 在室温下（每次洗涤10分钟），将样品浸入0.1 M磷酸钾缓冲液中，将样品洗涤3次。 用乙醇浓度上升（50%、70%、90%、95%和100%两次）使样品脱水。将样品浸入每个乙醇浓度中10分钟。 用临界点干燥机（-30 °C，0.1 Torr）干燥样品。 用 Pt （铂金） 离子涂布机 （30 mA 3 分钟; Pt 的厚度约为 20 nm） 涂覆样品。 在 5 kV 下通过 SEM 观察样品。 5. 传输电子显微镜 （TEM） 使用细胞刮刀从 NMJ 培养板中采集组织。用剃须刀刀片和凝胶将组织形状成小颗粒（3 mm 3），形成凝胶包裹的碎片。将凝胶包裹的片件与2%的半成醛和2%的谷胱甘肽在4°C的磷酸钾缓冲液中过夜。 将样品浸入0.1 M磷酸钾缓冲液（每次洗涤15分钟）中，将样品浸入3次。 在室温下用双精馏 H2O 中准备的 1% 三氧化二氮的样品进行后修复 1 小时。注意：此步骤必须在化学罩中完成。 重复步骤 5.2。 用乙醇浓度上升（50%、70%、90%、95%和100%两次）使样品脱水。将样品浸入每个乙醇浓度中10分钟。 吸气100%乙醇。将环氧树脂的容积比渗透到100%乙醇混合物（1：3、1：1和3：1）的样品中。在室温下，以 10 rpm 轻轻搅拌每个混合物 1 小时。 用纯环氧树脂代替环氧乙醇混合物，在室温下以 10 rpm 轻轻搅拌 4 小时。 4 小时后，用新鲜的环氧树脂刷新环氧树脂，并在室温下以 10 rpm 的转速轻轻搅拌。 将样品嵌入胶囊中，用新鲜的环氧树脂，在65°C的烤箱中固化样品。 超微切除术 在解剖显微镜下粗体修剪样品块，以的正确方向。 在超微体上用玻璃刀微调粗剪块，以获得光滑的表面。 用钻石刀从修剪良好的方块中准备 70 nm 超薄部分。使用 200 个网状碳型涂层铜网格检索超薄部分。 染色含有饱和醋酸化液的网格的超薄部分，用双蒸馏 H2O 准备 30 分钟，用双蒸馏 H2O（每次洗涤 10 分钟）清洗网格 3 次。 此外，将超薄部分与雷诺的铅柠檬酸盐19 （2.5%） 对比5分钟，用煮沸的H2O预冷至室温洗涤3次（每次洗涤10分钟）。在染色区域周围放几个氢氧化钠颗粒，以防止部分出现 二氧化碳沉淀。 观察 TEM 在 70 kV 的超薄部分。 6. 肌肉收缩和治疗 要触发 myotube 收缩，请在第 2.3 步中的培养基中添加 25 mM CaCl2。 可以在1\u20122分钟内观察到 myotube 的移动。 将 6 井板放在倒置显微镜的舞台上。通过活细胞显微镜录制一部 myotube 收缩电影。 要停止乳管收缩，请向培养基（300 ng/mL）添加咖干。然后将影片录制为步骤 6.2。 使用运动矢量分析软件打开影片文件，然后单击 “运动分析 “按钮分析影片。注：myotube 收缩显示为时动图形。电影是彩色编码，以显示 myotube 的移动速度。颜色编码的火花信号指示 myotube 的移动，其中红色显示最快的移动速度，蓝色显示最慢的移动速度。