Caratterizzazione macro-reologica del muco Gill Raker nella carpa argentata, Hypophthalmichthys molitrix

La carpa argentata, Hypophthalmichthys molitrix, è un alimentatore filtrante planctivoro e una specie invasiva che si è infiltrata in diversi corsi d’acqua naturali negli Stati Uniti. Questa specie è stata inizialmente introdotta nel bacino superiore del fiume Mississippi per controllare le fioriture algali^1,2,3. La carpa argentata è un alimentatore estremamente efficiente. Tipicamente, le sue dimensioni delle particelle alimentari consumabili vanno da 4 a 20 μm a zooplancton più grandi che sono circa 80 μm^3,4,5. Questa specie ha superato altri pesci nativi e può potenzialmente causare enormi danni ai corsi d’acqua nativi limitando le risorse disponibili^1,2,6. Pertanto, l’alimentazione del filtro di pesci come la carpa argentata e la carpa bighead rappresentano una grave minaccia per i Grandi Laghi^1,2,6,7,8.

I pesci che si nutrono di filtri possiedono organi speciali chiamati rastrellatori branchiali (GRI) con un sottile strato di muco che risiede sulla loro superficie. Questi organi migliorano l’efficienza della filtrazione e dell’aggregazione di piccole particelle dal fluido in entrata. L’obiettivo del protocollo qui presentato è quello di caratterizzare la proprietà non newtoniana del materiale di assottigliamento del taglio e lo stress di resa del muco GR acquisito dalla superficie interna dei rastrelli branchiali nella carpa argentata. Il valore dello stress di resa del GR-muco, accertato utilizzando un reometro rotazionale, è di interesse in questo studio. La tensione di snervamento misurata, chiamata anche “tensione di snervamento apparente”, dipende dai metodi di prova come la velocità di taglio costante o la deformazione oscillatoria dinamica di tipo^9,10. Il diradamento di taglio, “fluido di snervamento- stress”, subisce una transizione dal comportamento solido a quello simile a quello liquido a una sollecitazione critica applicata^9,11. Lo sforzo di snervamento apparente è lo sforzo di taglio minimo richiesto per avviare il flusso o quello in cui si osserva per la prima volta una deformazione plastica irreversibile quando il muco passa da un materiale gelatinoso a un materiale simile al fluido. Questo comportamento può essere osservato in materiali viscoelastici strutturati. La transizione dal comportamento gelatinoso a quello fluido del muco GR comporta due funzioni, ovvero un ruolo adesivo per raccogliere le particelle alimentari e un ruolo di veicolo di trasporto per assistere nel processo di consegna e filtrazione del particolato. La funzione estesa del muco include la creazione di barriere di diffusione nella resistenza alle malattie e nella respirazione, fornendo un rilascio controllato di fattori nutrizionali, componenti tossici ed escrezione, creando vie metaboliche per l’alimentazione e la nidificazione, aiutando nella protezione dei predatori e producendo modifiche dello strato limite che migliorano la locomozione e l’efficienza propulsiva^12,13,14.

A differenza dei fluidi semplici, i fluidi complessi come il muco possiedono proprietà che variano con le condizioni di flusso e richiedono parametri di misurazione aggiuntivi per definire il loro comportamento fisico su scala di massa. Per monitorare la viscosità e lo stress di snervamento del muco GR, le misurazioni reologiche vengono eseguite utilizzando un reometro rotazionale. Il reometro rotazionale applica una sollecitazione o una deformazione di taglio costante o oscillatoria per mezzo di un disco rotante a contatto con il campione di fluido e ne misura la risposta. La logica alla base dell’utilizzo di questo strumento e tecnica è che il reometro può fornire una serie di misurazioni per descrivere le proprietà del materiale del muco GR della carpa argentata, che non può essere definito dalla sola viscosità.

Il muco è un materiale viscoelastico e la sua risposta meccanica ad una deformazione imposta è compresa tra quella di un solido puro (governato dalla legge di elasticità di Hooke) e quella di un liquido puro (governato dalla legge di viscosità di Newton)^15,16. La complessa rete macromolecolare contenuta all’interno del muco può allungarsi e riorientarsi in risposta a forze esterne o deformazioni. Un reometro rotazionale è costituito da una geometria a cono e da una piastra di Peltier, come mostrato in Figura 1 e Figura 2 (vedere Tabella 1 per le specifiche della strumentazione). L’obiettivo di questo studio era quello di sviluppare un protocollo per determinare le proprietà reologiche del muco GR. Un vantaggio del reometro rotazionale rispetto a un viscosimetro è la sua capacità di effettuare misurazioni dinamiche utilizzando piccoli volumi di campione. Il volume del campione di muco GR in questo studio era di circa 1,4 ml. Il viscosimetro, d’altra parte, è limitato a velocità di taglio costanti e richiede grandi volumi di campione.

Si prevede che le proprietà reologiche del muco varieranno notevolmente all’interno dell’anatomia della carpa argentata. Ad esempio, le proprietà del muco che risiede sulle superfici GR possono essere diverse dall’organo epibranchiale. Per tenere conto della potenziale variabilità delle proprietà del muco in diverse regioni del pesce, il campione di muco GR acquisito è stato diluito e sono state create e testate soluzioni di tre concentrazioni utilizzando il reometro rotazionale. I dati e i risultati relativi alla reologia del muco riportati dopo l’esecuzione del protocollo hanno dimostrato l’efficacia della tecnica di misurazione. I dati illustrativi presentati in questo documento non sono destinati ad essere generalizzati all’intera popolazione di carpe argentate. Il protocollo qui presentato può essere esteso per studiare la reologia del muco su set di campioni più grandi per testare altre ipotesi.

Lo scopo di questo studio è dimostrare la variazione delle proprietà reologiche della reologia del muco GR con tre diverse concentrazioni di muco (400 mg/mL, 200 mg/mL e 100 mg/mL). La concentrazione di 400 mg/mL rappresenta il campione di muco crudo raccolto dai PR del pesce. L’acqua deionizzata (DI) è stata utilizzata per diluire il campione di muco crudo in concentrazioni di 200 mg/mL e 100 mg/mL. La diluizione dei campioni di muco ha permesso la valutazione del grado di assottigliamento del taglio e dello stress di resa apparente in funzione della concentrazione e la determinazione della concentrazione alla quale il muco GR passa al comportamento non newtoniano. Uno shaker è stato utilizzato per abbattere eventuali grandi grumi di muco nei campioni per mitigare gli errori nei dati reologici dovuti alla disomogeneità.

Nella maggior parte dei vertebrati, compresi i pesci, le macromolecole predominanti che formano muco sono glicoproteine (mucine) che tendono a gonfiarsi in acqua per intrecci o reticolazione chimica e creano un materiale gelatinoso^{12,13,17,18,19,20.} Le macromolecole ad alto peso molecolare, che formano gel e l’alto contenuto di acqua riflettono la scivolosità nel^{muco 13}. Un alto grado di interazioni inter-macromolecolari porta alla formazione di gel, mentre livelli più bassi di interazioni inter-macromolecolari o legami rotti provocano fluidi ad alta viscositಹ.

I processi di filtrazione del particolato alimentare nell’alimentazione del filtro per pesci sono aiutati da proprietà legate al muco GR come la coesione e la viscosità che determinano il suo potenziale di adesione e tack²². La forza dell’adesione a base di muco dipende da specifiche interazioni intermolecolari, elettrostatiche o idrofobiche²³. Sanderson et al.²⁴ hanno condotto uno studio sull’alimentazione in sospensione nel pesce nero in cui hanno trovato le prove dell’adesione a base di muco. Hanno affermato che l’adesione di particolati alimentari sospesi con una superficie mucosale è seguita dal trasporto di grumi aggregati di particelle legate insieme al muco da un flusso d’acqua diretto che agisce su di esso²⁴. Il muco esposto a velocità di taglio generate dal flusso d’acqua facilita la consegna di particolato alimentare agli organi digestivi. Le tecniche endoscopiche sono state utilizzate per osservare le particelle filtrate²⁴.

La letteratura sulla gamma di velocità di taglio e limiti pratici nei test reologici del muco GR è scarsa. Pertanto, è stata richiesta una guida da studi reologici su muco gastrico, nasale, cervicale e polmonare, muco della pelle di salmone, melma di hagfish e lubrificante superficiale osseo-articolare in cui sono stati studiati la caratterizzazione reologica e gli attributi non newtoniani^{11,12,25, 26,27,28,29,30,31.} Più recentemente, l’effetto del muco della pelle di pesce sulla locomozione e sull’efficienza propulsiva è stato studiato utilizzando la viscosimetria a velocità di taglio costante. Studi di reologia del muco cutaneo (senza alcuna diluizione o omogeneizzazione) relativi a orate, spigole e magre hanno dimostrato un comportamento non newtoniano a velocità di taglio tipicamente basse¹⁴.  In un altro studio correlato, i campioni di muco della pelle grezza dai lati dorsale e ventrale della sogliola senegalese sono risultati esibire un comportamento non newtoniano, indicando una maggiore viscosità del muco ventrale a tutte le velocità di taglio considerate³². Altri protocolli reologici relativi allo sviluppo dello scaffold idrogel e per sospensioni altamente concentrate mediante viscosimetro a velocità di taglio costante sono stati riportati anche in letteratura^33,34.

In questo studio, le proprietà del muco GR sono state studiate utilizzando un reometro rotazionale controllato dalla velocità di deformazione che è stato ampiamente utilizzato in esperimenti di reologia su fluidi biologici complessi²⁵. Per i fluidi newtoniani, la viscosità apparente rimane costante, è indipendente dalla velocità di taglio e le sollecitazioni di taglio variano linearmente con le velocità di deformazione di taglio (Figura 3A, B). Per i fluidi non newtoniani (come i fluidi di assottigliamento del taglio) la viscosità è dipendente dalla velocità di taglio o dalla storia della deformazione (Figura 3A, B). Il modulo di perdita (G”) rappresenta la misura in cui il materiale resiste alla tendenza al flusso ed è rappresentativo della viscosità del fluido (Figura 4). Il modulo di stoccaggio (G’) rappresenta la tendenza del materiale a recuperare la sua forma originale a seguito di deformazioni indotte da sollecitazioni ed è equivalente all’elasticità (Figura 4). L’angolo di fase (δ) o valore tangente di perdita, è calcolato dalla tangente inversa di G”/G’. Rappresenta l’equilibrio tra perdita di energia e stoccaggio ed è anche un parametro comune per caratterizzare i materiali viscoelastici (δ = 0° per un solido di Hookean; δ = 90° per un liquido viscoso; δ 45° per un liquido viscoelastico) (Figura 4)²⁵. La tensione di snervamento apparente (σ_y) nei fluidi strutturati rappresenta un cambiamento di stato che può essere osservato nei dati reologici da sweep allo stato stazionario e sweep dinamici stress-deformazione¹⁰. Se la sollecitazione esterna applicata è inferiore alla sollecitazione di snervata apparente, il materiale si deformerà elasticamente. Quando la sollecitazione supera la sollecitazione di snervamento apparente (contrassegnata come “sollecitazione media” nella Figura 3B), il materiale passerà dalla deformazione elastica a quella plastica e inizierà a fluire allo stato liquido³⁵. La misurazione del modulo di stoccaggio (G’) e del modulo di perdita (G”) nel campione di muco in condizioni di stress oscillatorio (o deformazione) quantifica il cambiamento dello stato materiale dal comportamento gelatinoso a quello viscoelastico simile al liquido.

I tipi di prove reometriche eseguite per monitorare i dati relativi al modulo di memorizzazione (G’), al modulo di perdita (G”) e alla viscosità apparente (η) sono qui descritti. I test di oscillazione dinamica (sweep di deformazione e sweep di frequenza) hanno monitorato G’ e G” sotto oscillazione controllata della geometria del cono. I test dinamici di deformazione hanno determinato la regione viscoelastica lineare (LVR) del muco monitorando la risposta intrinseca del materiale (Figura 4). Le sweep di deformazione sono state utilizzate per determinare il comportamento di resa a frequenza e temperatura di oscillazione costanti. I test di sweep a frequenza dinamica hanno monitorato la risposta del materiale all’aumento della frequenza (velocità di deformazione) a un’ampiezza costante (deformazione o sollecitazione) e temperatura. La deformazione è stata mantenuta nella regione viscoelastica lineare (LVR) per i test di sweep a frequenza dinamica. I test della velocità di taglio allo stato stazionario hanno monitorato la viscosità apparente (η) sotto rotazione costante della geometria del cono. Il muco GR è stato sottoposto a fasi di sollecitazione incrementali e la viscosità apparente (η, Pa.s) è stata monitorata per la variazione della velocità di taglio (ý, 1/s).

Il protocollo presentato in questo articolo tratta il muco GR come un materiale strutturato complesso di viscoelasticità sconosciuta con un certo intervallo di risposta viscoelastica lineare. Il muco del pesce è stato estratto dai GRI della carpa argentata durante una spedizione di pesca nella posizione del torrente Hart nel fiume Missouri dalla professoressa L. Patricia Hernandez (Dipartimento di Scienze Biologiche, The George Washington University) ^1,2,36.  Una matrice di GRI all’interno della bocca di una carpa argentata è mostrata nella Figura 5A e un disegno schematico è presentato nella Figura 5B. Un GR asportato è mostrato nella Figura 5C.  L’estrazione del muco dai GRI della carpa argentata è presentata come esempio nei disegni schematici, Figura 5D,E. Tutte le prove del reometro sono state eseguite a temperatura costante e controllata di 22 ± 0,002 °C, la temperatura registrata nel sito di pesca^1,2,36.  Ogni campione di muco è stato testato tre volte con il reometro e i risultati medi sono presentati insieme alle barre di errore statistiche.