التنشيط البصري الوراثي للمسارات الوراثية في شرائح الدماغ وتعديل الاستجابات بواسطة التخدير المتطاير
Summary
يمكن استخدام شرائح الدماغ خارج الجسم الحي لدراسة آثار التخدير المتطاير على الاستجابات المستحثة للمدخلات القريبة. يتم استخدام علم البصريات الوراثي لتنشيط القشرة المهادية والقشرية بشكل مستقل إلى القشرة المخية الجديدة غير الأولية ، ويتم تعديل الاستجابات المشبكية والشبكة باستخدام الأيزوفلوران.
Abstract
يؤثر التخدير على الوعي جزئيا من خلال أفعالهم على الدوائر القشرية المهادية. ومع ذلك ، فإن مدى تأثير التخدير المتطاير على المكونات الخلوية والشبكية المتميزة لهذه الدوائر لا يزال غير واضح. توفر شرائح الدماغ خارج الجسم الحي وسيلة يمكن للمحققين من خلالها التحقيق في المكونات المنفصلة للشبكات المعقدة وفك تشابك الآليات المحتملة الكامنة وراء آثار التخدير المتطاير على الاستجابات المستحثة. لعزل التأثيرات الدوائية المحتملة الخاصة بنوع الخلية ومسارها في شرائح الدماغ ، يجب أن يكون الباحثون قادرين على تنشيط مسارات الألياف القريبة بشكل مستقل ، وتحديد المجموعات غير المتداخلة من الخلايا ، وتطبيق التخدير المتطاير على الأنسجة في محلول مائي. في هذا البروتوكول ، يتم وصف طرق لقياس الاستجابات المستحثة بصريا لمسارين مستقلين مرتبطين بالقشرة المخية الجديدة في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي. يتم تسجيل الاستجابات خارج الخلية لفحص نشاط الشبكة ويتم إجراء تسجيلات مشبك رقعة الخلية الكاملة المستهدفة في الخلايا العصبية الداخلية الإيجابية للسوماتوستاتين والبارفالبومين. يتم وصف توصيل تركيزات الأيزوفلوران ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية عبر السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي لتعديل الاستجابات الخلوية والشبكية.
Introduction
تم استخدام التخدير المتطاير في كل مكان في مجموعة متنوعة من الإعدادات السريرية والأكاديمية لأكثر من قرن. فئات متميزة من التخدير لها أهداف جزيئية فريدة من نوعها ، وغالبا ما تكون غير متداخلة1،2،3 ، ولكن جميعها تقريبا تنتج فقدان الوعي. في حين أن آثارها السلوكية يمكن التنبؤ بها تماما ، فإن الآليات التي يحفز بها التخدير فقدان الوعي غير معروفة إلى حد كبير. قد يؤثر التخدير في نهاية المطاف على كل من مستوى الوعي ومحتوياته من خلال الإجراءات على الدوائر القشرية ، مما يعطل تكامل المعلومات في جميع أنحاء التسلسل الهرمي القشري4،5،6،7،8،9. على نطاق أوسع ، قد يلعب تعديل الدوائر القشرية دورا في10 أو دوائيا 11 حالة وعي متغيرة تجريبيا ، وقد يكون متورطا أيضا في النوم 12 وفي الاضطرابات الفسيولوجية المرضية للوعي 13,14.
يمكن أن يعزى مراوغة الآليات الكامنة وراء فقدان الوعي وعودته أثناء التخدير جزئيا إلى الإجراءات غير الخطية والتآزرية للتخدير على المستويات الخلوية والشبكة والأنظمة15. على سبيل المثال ، يثبط الأيزوفلوران النشاط داخل مناطق الدماغ المختارة 16،17،18 ، ويضعف الاتصال بين مناطق الدماغ البعيدة 19،20،21،22،23 ، ويقلل من الاستجابات المشبكية بطريقة خاصة بالمسار24،25 . ما هي آثار التخدير ، من الجزيئي إلى مستوى الأنظمة ، ضرورية أو كافية لإحداث فقدان الوعي لا تزال غير واضحة. بالإضافة إلى التحقيقات السريرية الموضوعية للوعي باستخدام التقنيات غير الغازية19،20،26 ، من المهم أن يسعى التجريبيون إلى فك تشابك التفاعلات الخلوية والشبكة المتميزة التي تخدم التجربة الواعية.
من خلال تبسيط التفاعلات المعقدة الموجودة في الدماغ السليم ، تسمح شرائح الدماغ خارج الجسم الحي بدراسة المكونات المعزولة للأنظمة الديناميكية للدماغ9. يجمع إعداد الشريحة المخفضة بين فوائد الهياكل التشريحية السليمة نسبيا للدوائر العصبية المحلية مع تنوع التلاعب في المختبر. ومع ذلك ، حتى وقت قريب ، حالت القيود المنهجية دون دراسة الخصائص المتشابكة والدائرة للمدخلات طويلة المدى في شرائح الدماغ27,28 ؛ جعل المسار المتعرج لمسالك الألياف القشرية تنشيط المسارات المستقلة القريبة مستحيلا عن طريق التحفيز الكهربائي.
يمثل التحقيق في آثار عوامل التخدير على مستحضرات شريحة الدماغ تحديات إضافية. في غياب الجهاز التنفسي والدورة الدموية السليم ، يجب تطبيق عوامل التخدير على الحمام ، ومطابقة التركيزات بعناية مع تركيزات موقع التأثير المقدرة. بالنسبة للعديد من عوامل التخدير الوريدي ، فإن المعدل البطيء للتوازن في الأنسجة يجعل التحقيقات الدوائية التقليدية شاقة29,30. يعد التحقيق في تأثيرات تخدير الغاز المتطاير في الاستعدادات خارج الجسم الحي أكثر قابلية للسحب ، ولكنه يمثل أيضا تحديات. وتشمل هذه تحويل جرعات الضغط الجزئي المستنشقة إلى تركيزات مائية ، والحاجة إلى نظام توصيل معدل للدواء إلى الأنسجة عبر السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي31.
هنا ، يتم وصف الطرق التي يمكن للمحققين من خلالها الاستفادة من الخصائص الفيزيائية والكيميائية الموثقة جيدا للإيزوفلوران المخدر المتطاير لتوصيل الدواء إلى شرائح الدماغ خارج الجسم الحي ، وتنشيط المدخلات الخاصة بالمسار والطبقة إلى منطقة قشرية ذات أهمية ذات دقة مكانية زمانية عالية ، وإجراء تسجيلات صفائحية متزامنة وتسجيلات مشبك التصحيح المستهدفة من مجموعات مختارة من الخلايا العصبية. تسمح هذه الإجراءات مجتمعة للباحثين بقياس التغيرات المتطايرة الناجمة عن التخدير في العديد من خصائص الاستجابة الكهروفسيولوجية التي يمكن ملاحظتها ، من المشبكي إلى مستوى الشبكة المحلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة، يتم وصف بروتوكول لتقييم الاستجابات داخل وخارج الخلية للمسارات القريبة المنشطة بشكل انتقائي في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي.
يسمح استخدام الأدوات البصرية الجينية ومخططات التسجيل المتوازية للمحققين بالتحقيق في استجابات السكان المحليين للمدخلات القريبة م?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون برايان كراوس على الدعم الفني والتوجيه بشأن هذا المشروع.
تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية الدولية لأبحاث التخدير (IMRA to AR) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01 GM109086 إلى MIB) ، وقسم التخدير ، كلية الطب والصحة العامة ، جامعة ويسكونسن ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية.
Materials
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5×2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
- Baumgart, J. P., et al. Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).
- Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P. Isoflurane inhibits the neurotransmitter release machinery. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 1265-1273 (2009).
- Xie, Z., et al. Interaction of anesthetics with neurotransmitter release machinery proteins. Journal of Neurophysiology. 109 (3), 758-767 (2013).
- Crick, F., Koch, C. A framework for consciousness. Nature Neurosciences. 6 (2), 119-126 (2003).
- Koch, C., Massimini, M., Boly, M., Tononi, G. Neural correlates of consciousness: progress and problems. Nature Reviews Neurosciences. 17 (5), 307-321 (2016).
- Dehaene, S., Changeux, J. P. Experimental and theoretical approaches to conscious processing. Neuron. 70 (2), 200-227 (2011).
- Friston, K. A theory of cortical responses. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 360 (1456), 815-836 (2005).
- Mashour, G. A., Hudetz, A. G. Bottom-Up and Top-Down Mechanisms of General Anesthetics Modulate Different Dimensions of Consciousness. Frontiers in Neural Circuits. 11, 44 (2017).
- Voss, L. J., Garcia, P. S., Hentschke, H., Banks, M. I. Understanding the Effects of General Anesthetics on Cortical Network Activity Using Ex Vivo Preparations. Anesthesiology. 130 (6), 1049-1063 (2019).
- Redinbaugh, M. J., et al. Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex. Neuron. 105 (4), 0896 (2020).
- Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics. Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).
- Mak-McCully, R. A., et al. Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans. Nature communications. 8 (1), 15499 (2017).
- Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G. Consciousness and anesthesia. Science. 322 (5903), 876-880 (2008).
- Sanders, R. D., Maze, M. Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states. Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).
- Hemmings, H. C., et al. Towards a Comprehensive Understanding of Anesthetic Mechanisms of Action: A Decade of Discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (7), 464-481 (2019).
- Nourski, K. V., et al. Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study. Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).
- Liu, X., et al. Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory. Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).
- Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane. British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).
- Lee, U., et al. Disruption of frontal-parietal communication by ketamine, propofol, and sevoflurane. Anesthesiology. 118 (6), 1264-1275 (2013).
- Ferrarelli, F., et al. Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).
- Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients. PLoS.One. 6 (10), 25155 (2011).
- Lee, M., et al. Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation. Scientific Reports. 7 (1), 16791 (2017).
- Murphy, M., et al. Propofol anesthesia and sleep: a high-density EEG study. Sleep. 34 (3), 283-291 (2011).
- Murphy, C., Krause, B., Banks, M. Selective effects of isoflurane on cortico-cortical feedback afferent responses in murine non-primary neocortex. British Journal of Anaesthesiology. 123 (4), 488-496 (2019).
- Raz, A., et al. Preferential effect of isoflurane on top-down versus bottom-up pathways in sensory cortex. Frontiers in System Neurosciences. 8, 191 (2014).
- Schrouff, J., et al. Brain functional integration decreases during propofol-induced loss of consciousness. Neuroimage. 57 (1), 198-205 (2011).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-Specific Feedforward Circuits between Thalamus and Neocortex Revealed by Selective Optical Stimulation of Axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gredell, J. A., Turnquist, P. A., MacIver, M. B., Pearce, R. A. Determination of diffusion and partition coefficients of propofol in rat brain tissue: implications for studies of drug action in vitro. BJA: British Journal of Anaesthesia. 93 (6), 810-817 (2004).
- Benkwitz, C., et al. Determination of the EC50 amnesic concentration of etomidate and its diffusion profile in brain tissue: implications for in vitro studies. Anesthesiology. 106 (1), 114-123 (2007).
- Franks, N. P., Lieb, W. R. Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels. British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).
- Honemann, C. W., Washington, J., Honemann, M. C., Nietgen, G. W., Durieux, M. E. Partition coefficients of volatile anesthetics in aqueous electrolyte solutions at various temperatures. Anesthesiology. 89 (4), 1032-1035 (1998).
- Au – Segev, A., Au – Garcia-Oscos, F., Au – Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Experimental Physiology. 96 (1), 19-25 (2011).
- Banks, M. I., Pearce, R. A. Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects. Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).
- Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).
