Optogenetische Aktivierung afferenter Signalwege in Hirnschnitten und Modulation von Reaktionen durch flüchtige Anästhetika
Summary
Ex-vivo-Gehirnschnitte können verwendet werden, um die Auswirkungen von flüchtigen Anästhetika auf evozierte Reaktionen auf afferente Inputs zu untersuchen. Optogenetik wird eingesetzt, um thalamokortikale und kortikokkortikale Afferenzen für nicht-primären Neokortex unabhängig zu aktivieren, und synaptische und Netzwerkantworten werden mit Isofluran moduliert.
Abstract
Anästhetika beeinflussen das Bewusstsein zum Teil durch ihre Wirkung auf thalamokortikale Schaltkreise. Das Ausmaß, in dem flüchtige Anästhetika unterschiedliche Zell- und Netzwerkkomponenten dieser Schaltkreise beeinflussen, bleibt jedoch unklar. Ex-vivo-Gehirnschnitte bieten ein Mittel, mit dem Forscher diskrete Komponenten komplexer Netzwerke untersuchen und potenzielle Mechanismen entwirren können, die den Auswirkungen flüchtiger Anästhetika auf evozierte Reaktionen zugrunde liegen. Um potenzielle zelltyp- und wegspezifische Arzneimittelwirkungen in Gehirnschnitten zu isolieren, müssen die Forscher in der Lage sein, unabhängig voneinander afferente Faserwege zu aktivieren, nicht überlappende Zellpopulationen zu identifizieren und flüchtige Anästhetika in wässriger Lösung auf das Gewebe aufzutragen. In diesem Protokoll werden Methoden beschrieben, um optogenetisch evozierte Reaktionen auf zwei unabhängige afferente Signalwege zum Neocortex in ex vivo Gehirnschnitten zu messen. Extrazelluläre Reaktionen werden auf die Assay-Netzwerkaktivität aufgezeichnet und gezielte Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen werden in Somatostatin- und Parvalbumin-positiven Interneuronen durchgeführt. Die Abgabe physiologisch relevanter Isoflurankonzentrationen über künstliche Rückenmarksflüssigkeit zur Modulation von Zell- und Netzwerkantworten wird beschrieben.
Introduction
Flüchtige Anästhetika werden seit mehr als einem Jahrhundert ubiquitär in einer Vielzahl von klinischen und akademischen Umgebungen eingesetzt. Verschiedene Klassen von Anästhetika haben einzigartige, oft nicht überlappende molekulare Ziele 1,2,3, aber fast alle von ihnen erzeugen Bewusstlosigkeit. Während ihre Verhaltenseffekte ziemlich vorhersehbar sind, sind die Mechanismen, durch die Anästhetika Bewusstseinsverlust induzieren, weitgehend unbekannt. Anästhetika können letztendlich sowohl das Niveau als auch den Inhalt des Bewusstseins durch Aktionen auf kortikothalamische Schaltkreise beeinflussen und die Integration von Informationen in der gesamten kortikalen Hierarchiestören 4,5,6,7,8,9. Im weiteren Sinne kann die Modulation kortikothalamischer Schaltkreise eine Rolle bei experimentell 10 oder pharmakologisch 11 veränderten Bewusstseinszuständen spielen und kann auch mit Schlafstörungen12 und pathophysiologischen Bewusstseinsstörungen13,14 in Verbindung gebracht werden.
Die Flüchtigkeit der Mechanismen, die dem Verlust und der Rückkehr des Bewusstseins während der Anästhesie zugrunde liegen, kann teilweise auf nichtlineare, synergistische Wirkungen von Anästhetika auf zellulärer, Netzwerk- und Systemebene zurückgeführt werden15. Isofluran zum Beispiel unterdrückt die Aktivität innerhalb der ausgewählten Hirnregionen 16,17,18, beeinträchtigt die Konnektivität zwischen entfernten Hirnregionen 19,20,21,22,23 und verringert synaptische Reaktionen in einer wegspezifischen Weise24,25 . Welche Wirkungen von Anästhetika, von der molekularen bis zur Systemebene, notwendig oder ausreichend sind, um Bewusstseinsverlust zu bewirken, bleibt unklar. Zusätzlich zu substantiellen klinischen Untersuchungen des Bewusstseins mit nicht-invasiven Techniken 19,20,26 ist es wichtig, dass Experimentatoren versuchen, die unterschiedlichen zellulären und Netzwerkinteraktionen, die der bewussten Erfahrung dienen, zu entwirren.
Durch die Vereinfachung der komplexen Interaktionen im intakten Gehirn ermöglichen Ex-vivo-Gehirnschnitte die Untersuchung isolierter Komponenten der dynamischen Systeme des Gehirns9. Ein reduziertes Schnittpräparat kombiniert die Vorteile relativ intakter anatomischer Strukturen lokaler neuronaler Schaltkreise mit der Vielseitigkeit von In-vitro-Manipulationen. Bis vor kurzem haben methodische Einschränkungen jedoch die Untersuchung der synaptischen und Schaltkreiseigenschaften von Langstreckeneingaben in Gehirnschnitten ausgeschlossen27,28; Der gewundene Weg der kortikothalamischen Faserbahnen machte die Aktivierung unabhängiger afferenter Bahnen durch elektrische Stimulation nahezu unmöglich.
Die Untersuchung der Wirkung von Anästhetika auf die Gehirnschnittpräparate stellt zusätzliche Herausforderungen dar. In Ermangelung eines intakten Atmungs- und Kreislaufsystems müssen Anästhetika im Bad angewendet und die Konzentrationen sorgfältig auf die geschätzten Konzentrationen an der Wirkungsstelle abgestimmt werden. Bei vielen intravenösen Anästhetika macht die langsame Gleichgewichtsrate im Gewebe traditionelle pharmakologische Untersuchungen mühsam 29,30. Die Untersuchung der Auswirkungen von flüchtigen Gasanästhetika in Ex-vivo-Präparaten ist handhabbarer, stellt aber auch Herausforderungen dar. Dazu gehören die Umwandlung inhalativer Partialdruckdosen in wässrige Konzentrationen und die Notwendigkeit eines modifizierten Verabreichungssystems des Arzneimittels zum Gewebe über künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit31.
Hier werden Methoden beschrieben, mit denen Forscher die gut dokumentierten physikochemischen Eigenschaften des flüchtigen Anästhetikums Isofluran für die Wirkstoffabgabe an ex vivo Gehirnschnitte nutzen, weg- und schichtspezifische Eingaben in einen kortikalen Bereich von Interesse mit hoher raumzeitlicher Auflösung aktivieren und simultane laminare Aufnahmen und gezielte Patch-Clamp-Aufnahmen von ausgewählten Neuronenpopulationen durchführen können. In Kombination ermöglichen diese Verfahren den Forschern, flüchtige, durch Anästhetika induzierte Veränderungen in mehreren beobachtbaren elektrophysiologischen Reaktionseigenschaften von der synaptischen bis zur lokalen Netzwerkebene zu messen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Manuskript wird ein Protokoll zur Bewertung intra- und extrazellulärer Reaktionen auf selektiv aktivierte afferente Signalwege in ex vivo Hirnschnitten beschrieben.
Die Verwendung optogenetischer Werkzeuge und paralleler Aufzeichnungsschemata ermöglicht es Forschern, Reaktionen lokaler Populationen auf afferente Eingaben aus entfernten Hirnregionen zu untersuchen und gleichzeitig von Zielpopulationen von Interneuronen aufzuzeichnen. Durch den Einsatz optogenetischer Technologie kö…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Bryan Krause für die technische Unterstützung und Anleitung zu diesem Projekt.
Diese Arbeit wurde von der International Anesthesia Research Society (IMRA bis AR), den National Institutes of Health (R01 GM109086 bis MIB) und der Abteilung für Anästhesiologie, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin, Madison, WI, USA, unterstützt.
Materials
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5×2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
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