राइनल कॉर्टेक्स-हिप्पोकैम्पस ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस संस्कृतियों में मिर्गी का एक मॉडल
Summary
यहां, हम राइनल कॉर्टेक्स-हिप्पोकैम्पस ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस की तैयारी का वर्णन करते हैं। सीरम के क्रमिक और नियंत्रित अभाव के तहत, ये स्लाइस मिर्गी जैसी घटनाओं को चित्रित करते हैं और मिर्गी के पूर्व वीवो मॉडल को माना जा सकता है। यह प्रणाली सहज गतिविधि की गतिशीलता की निगरानी के साथ-साथ मिर्गी के दौरान न्यूरोइंफ्लैमेटरी सुविधाओं की प्रगति का आकलन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है।
Abstract
ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस संस्कृतियों का व्यापक रूप से मस्तिष्क विकारों को मॉडल करने के लिए उपयोग किया गया है और दवा की न्यूरोप्रोटेक्टिव और चिकित्सीय क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उत्कृष्ट मंच माना जाता है। ऑर्गेनोटीपिक स्लाइस को निकाले गए ऊतकों से तैयार किया जाता है और एक जटिल बहुकोशिकीय पूर्व वीवो पर्यावरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। वे मस्तिष्क की कोशिकाओं के त्रि-आयामी साइटोआर्किटेचर और स्थानीय वातावरण को संरक्षित करते हैं, न्यूरोनल कनेक्टिविटी और न्यूरॉन-ग्लिया पारस्परिक बातचीत को बनाए रखते हैं। हिप्पोकैम्पल ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस को मिर्गी के बुनियादी तंत्र का पता लगाने के लिए उपयुक्त माना जाता है, लेकिन मिर्गी के नैदानिक अनुसंधान और पशु मॉडल ने सुझाव दिया है कि पेरिहिनल और एंटोराइनल कॉर्टिस से बना राइनल कॉर्टेक्स, जब्ती पीढ़ी में एक प्रासंगिक भूमिका निभाता है।
यहां, हम राइनल कॉर्टेक्स-हिप्पोकैम्पस ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस की तैयारी का वर्णन करते हैं। शारीरिक तापमान पर और औषधीय जोड़तोड़ के अभाव में पूर्ण विकास माध्यम के साथ परफ्यूजन के तहत CA3 क्षेत्र से सहज गतिविधि की रिकॉर्डिंग से पता चला है कि इन स्लाइस संस्कृति में समय भर में मिर्गी की तरह घटनाओं को विकसित दर्शाती है । प्रोपिडियम आयोडाइड तेज परख के माध्यम से बढ़ी हुई कोशिका मृत्यु, और फ्लोरेसेंस-युग्मित इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ मूल्यांकन किए गए ग्लियोसिस को भी देखा गया। प्रस्तुत प्रयोगात्मक दृष्टिकोण एक मंच के रूप में राइनल कॉर्टेक्स-हिप्पोकैम्पस ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस संस्कृतियों के मूल्य पर प्रकाश डाला गया है ताकि मिर्गी की गतिशीलता और प्रगति का अध्ययन किया जा सके और इस मस्तिष्क विकृति के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों को स्क्रीन किया जा सके ।
Introduction
मिर्गी, दुनिया भर में सबसे प्रचलित न्यूरोलॉजिक विकारों में से एक, मस्तिष्क में सिंक्रोनाइज्ड और अत्यधिक न्यूरोनल गतिविधि की आवधिक और अप्रत्याशित घटना की विशेषता है। विभिन्न एंटीएपिप्टिक दवाओं (AEDs) उपलब्ध होने के बावजूद, मिर्गी के साथ रोगियों के एक तिहाई चिकित्सा1 के लिए रिफ्रैक्टरी हैं और दौरे और संज्ञानात्मक गिरावट का अनुभव जारी है। इसके अलावा, उपलब्ध AEDs न्यूरोनल गतिविधि पर उनके अपेक्षाकृत सामान्यीकृत कार्यों के कारण अनुभूति में बाधा डालते हैं। मिर्गी मनुष्यों में अध्ययन करना मुश्किल है, कई और विषम मिर्गी की चोटों के कारण, दशकों तक चलने वाले लंबे अव्यक्त अवधि, और पहले सहज जब्ती के बाद एंटीकोनवुल्सेंट उपचार के भ्रामक प्रभाव।
मिर्गी के उपचार के लिए संभावित चिकित्सीय एजेंटों की पहचान मिर्गी के पशु मॉडल के कारण संभव हो गई है: 1) आनुवंशिक मॉडल, जो आनुवंशिक रूप से संवेदनशील जानवरों का उपयोग करते हैं जिसमें दौरे अनायास या संवेदी उत्तेजना के जवाब में होते हैं; 2) विद्युत उत्तेजना प्रेरित दौरे के मॉडल; और 3) जब्ती प्रेरण के औषधीय मॉडल जो पिलोकार्पाइन (एक मस्केरिनिक रिसेप्टर एगोनिस्ट), काइनेट (एक काइनेट रिसेप्टर एगोनिस्ट) या 4-अमीनोपाइरिडीन (एक पोटेशियम चैनल अवरोधक) का उपयोग करते हैं। ये मॉडल व्यवहार परिवर्तनों की समझ में महत्वपूर्ण थे, साथ ही मिर्गी अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र, और उन्होंने कई AEDs2की खोज की है।
पूर्व वीवो तैयारी मिर्गी और इकोजेनेसिस में अंतर्निहित तंत्र का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण भी हैं। तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस, जो 6-12 घंटे की अवधि में जीवित कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन को सक्षम करते हैं, और ऑर्गेनोथिपिक हिप्पोकैम्पल स्लाइस जिन्हें एक इनक्यूबेटर में दिनों या हफ्तों की अवधि में संरक्षित किया जा सकताहै, 3मिर्गी गतिविधि के अध्ययन में बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है।
ऑर्गेनोटिपिक मस्तिष्क स्लाइस निकाले गए ऊतक से तैयार किए जाते हैं और मस्तिष्क के एक शारीरिक त्रि-आयामी मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं। ये स्लाइस रुचि के क्षेत्र के साइटोआर्किटेचर को संरक्षित करते हैं और इसमें मस्तिष्क की सभी कोशिकाएं और उनके अंतरकोशिकीय संचारशामिलहैं । दीर्घकालिक ऑर्गेनोटिपिक संस्कृतियों के लिए सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला क्षेत्र हिप्पोकैम्पस है, क्योंकि यह क्षेत्र कई न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियों में न्यूरोनल हानि से प्रभावित है। वे व्यापक रूप से मस्तिष्क विकारों मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया है और एक दवा के न्यूरोप्रोटेक्टिव और चिकित्सीय क्षमता5, 6का आकलन करने के लिए उत्कृष्ट उपकरण मानाजाताहै । हिप्पोकैम्पस ऑर्गेनोटीपिकस्लाइस7,8,9,10में मिर्गी, स्ट्रोक और ए-प्रेरित विषाक्तता के मॉडल ों का वर्णन किया गया था। पार्किंसंस रोग वेंट्रल मेसेसेफेलन और स्ट्राइटम में पता लगाया गया था, साथ ही कॉर्टेक्स-कॉर्पस कैलोसम-स्ट्राटम-सबस्टेंटिया निग्रा, ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस11। ऑर्गेनोटीपिक सेरिबेलर स्लाइस संस्कृतियां एक्सोन माइलियनेशन और सेरिबेलर कार्यों के कई पहलुओं की नकल करती हैं और कई स्क्लेरोसिस12में उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों की जांच के लिए एक व्यापक मॉडल हैं।
हालांकि, मिर्गी के नैदानिक अनुसंधान और पशु मॉडल ने सुझाव दिया है कि पेरिहिनल और एंटोराइनल कॉर्टिस द्वारा रचित राइनल कॉर्टेक्स, जब्ती पीढ़ी13में भूमिका निभाता है। इस प्रकार, राइनल कॉर्टेक्स-हिप्पोकैम्पस ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस में मिर्गी का एक मॉडल14 स्थापितकिया गया था। सीरम के क्रमिक और नियंत्रित अभाव के तहत, राइनल कॉर्टेक्स-हिप्पोकैम्पस ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस विकसित मिर्गी जैसी घटनाओं को दर्शाते हैं, हमेशा सीरम युक्त माध्यम में रखे गए अनुरूप स्लाइस के विपरीत।
मिर्गी में, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के कई तीव्र और पुराने रोगों के रूप में, न्यूरोसेंट्रिक दृष्टि अंतर्निहित रोग शुरुआत और प्रगति तंत्र को स्पष्ट करने में विफल रहती है। नैदानिक और प्रयोगात्मक साक्ष्य मस्तिष्क की सूजन को इंगित करते हैं, जिसमें माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स एक प्रासंगिक भूमिका निभाते हैं, क्योंकि मिर्गी की प्रक्रिया में योगदान देने वाले प्रमुख खिलाड़ियों में से एक है। मिर्गी के पशु मॉडल में औषधीय प्रयोगों से पता चलता है कि एंटीपीलेप्टोजेनिक प्रभाव समर्थक भड़काऊ रास्तों को लक्षित करके प्राप्त किया जा सकता है, और आजकल न्यूरोइंफ्लैमेशन को मिर्गी15के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोणों के विकास के लिए एक उपन्यास विकल्प माना जाता है।
यहां, हम राइनल कॉर्टेक्स-हिप्पोकैम्पस ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस संस्कृतियों की तैयारी के साथ-साथ उनसे सहज मिर्गी गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए विवरण का अच्छी तरह से वर्णन करते हैं। हम इस बात पर प्रकाश डालते हैं कि यह प्रणाली मिर्गी के कई न्यूरोइंफ्लेमेटर पहलुओं की नकल करती है, इस प्रकार इस विकृति में ग्लियल कोशिकाओं और न्यूरोइनफ्लेमेशन की भूमिका का पता लगाने के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, यह मिर्गी के लिए संभावित चिकित्सीय दृष्टिकोणों की स्क्रीनिंग के लिए एक आसान उपयोग मंच का प्रतिनिधित्व करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मिर्गी के पशु मॉडल कई AEDs की खोज के लिए महत्वपूर्ण रहा है, लेकिन वे कई जानवरों की आवश्यकता है और उनमें से ज्यादातर समय लेने वाले जब्ती शुरू करने के लिए अव्यक्त अवधि के कारण कर रहे हैं । हिप्पोकैम्पस तीव्र स्लाइस में मिर्गी गतिविधि के कम मैग्नीशियम प्रेरण को भी साहित्य 3 में अच्छीतरहसे संशोधित किया गया है, लेकिन तीव्र स्लाइस में 6-12 घंटे की व्यवहार्यता होती है जिससे दीर्घकालिक परिवर्तनों का आकलन करना असंभव हो जाता है। ऑर्गेनोटीपिक स्लाइस को संस्कृति में दिनों-सप्ताह तक बनाए रखा जा सकता है, जिससे तीव्र स्लाइस के छोटे व्यवहार्यता समय को दूर करने की अनुमति मिलती है, और ऑर्गेनोटीपिक हिप्पोकैम्पस स्लाइस में मिर्गी के मॉडल3,7,8प्रस्तावित किए गए हैं।
यहां हम ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस की तैयारी का वर्णन करते हैं, जिसमें राइनल कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस शामिल हैं। ये स्लाइस प्रति पशु तैयार करने के लिए 15-20 मिनट लेते हैं, पशु बलि से आवेषण पर स्लाइस की नियुक्ति तक शुरू करते हैं, और प्रति गोलार्द्ध 6-8 स्लाइस प्राप्त किए जा सकते हैं। हिप्पोकैम्पस को बेनकाब करने के लिए गोलार्द्ध खोलते समय और टुकड़ा करने की क्रिया के बाद फिल्टर पेपर से ऊतक को हटाते समय अतिरिक्त देखभाल की जानी चाहिए। हिप्पोकैम्पस के ऊपर अतिरिक्त ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान स्लाइस अखंडता से भी समझौता कर सकते हैं।
राइनल कॉर्टेक्स-हिप्पोकैम्पस ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस वीवो मिर्गी में एक विकसित मिर्गी जैसी गतिविधि को दर्शाते हैं। संस्कृति में एक सप्ताह के बाद, अधिकांश स्लाइस मिश्रित अंतरिक्त और ictal जैसी गतिविधि को दर्शाते हैं, जो संस्कृति में समय के साथ पूरी तरह से आईसीटील जैसी घटनाओं की ओर बढ़ता है। अब तक, हमने 2-3 सप्ताह के साथ स्लाइस में कुछ इंटरनिकल डिस्चार्ज दर्ज किए हैं। इस प्रणाली में, मिर्गी जैसी गतिविधि ऑर्गेनोटिपिक हिप्पोकैम्पल स्लाइस की तुलना में तेजी से विकसित होती है। यह राइनल कॉर्टेक्स की उपस्थिति के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जो हिप्पोकैम्पस के लिए अधिकांश कार्यात्मक इनपुट को बरकरार रखता है। इस समस्या को पूरी तरह से हल करने के लिए, संस्कृति में समय भर में इन स्लाइस द्वारा प्रदर्शित मिर्गी के संकेतों का एक पूर्ण लक्षण वर्णन, जैसे कि ictal घटनाओं की संख्या और अवधि, उनके आयाम और आवृत्ति के साथ, वर्तमान में किया जा रहा है ।
इस प्रणाली को तीन सप्ताह से अधिक समय तक संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है, और मिर्गी के कई आणविक सहसंबंधों की नकल करता है, जैसे न्यूरोनल डेथ, माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स की सक्रियता और प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स14का उत्पादन बढ़ा, जिससे इन पहलुओं का दीर्घकालिक लक्षण वर्णन होता है। यह एक आसान उपयोग स्क्रीनिंग मंच का भी प्रतिनिधित्व करता है, जहां विशिष्ट सेलुलर रास्तों को लक्षित करने वाले औषधीय हस्तक्षेपों को लागू किया जा सकता है और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों का परीक्षण किया जा सकता है। निस्संदेह, यहां प्रस्तुत प्रणाली मिर्गी के तंत्र को और अधिक प्रबुद्ध करने में मदद कर सकती है।
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक छवि अधिग्रहण से संबंधित सभी सुझावों के लिए इंस्टीट्यूटो डी मेडिसिना मॉलिक्यूलर जोआओ लोबो एंट्यून्स की बायोइमेजिंग यूनिट को स्वीकार करना चाहते हैं।
इस परियोजना को अनुदान समझौते Nº 952455 के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ है, Fundação पैरा एक Ciênciae Tecnologia (FCT) परियोजना PTDC/MEDFAR/30933/2017 के माध्यम से, और Faculdade de मेडिसना दा Unsiveridade de लिस्बोआ ।
Materials
| 50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
| Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
| Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
| Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
| Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
| Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
| B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
| Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
| Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
| Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
| Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
| D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
| Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
| Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
| Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
| Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
| Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
| INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
| Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
| Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
| L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
| Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
| Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
| Nail polish | Cliché | ||
| Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
| Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
| Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
| Phosphate standard solutions, PO₄3- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
| Platinum 5 blades | Gillette | ||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
| Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
| Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
| TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
| Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
| Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 |
References
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