Aplicação de terapia phage para neutralizar pseudomonas aeruginosa infecção em embriões de zebrafish fibrose cística
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para a infecção por Pseudomonas aeruginosa e aplicação de terapia de phage em embriões de zebrafish fibrose cística (CF).
Abstract
A resistência antimicrobiana, uma das principais consequências da incerteza diagnóstica e da superprescrição antimicrobiana, é uma causa cada vez mais reconhecida de infecções graves, complicações e mortalidade em todo o mundo com um enorme impacto em nossa sociedade e no sistema de saúde. Em particular, pacientes com sistemas imunológicos comprometidos ou patologias pré-existentes e crônicas, como a fibrose cística (CF), são submetidos a tratamentos antibióticos frequentes para controlar as infecções com a aparência e difusão de isolados resistentes a multidroga. Portanto, é urgente abordar terapias alternativas para combater infecções bacterianas. O uso de bacteriófagos, os inimigos naturais das bactérias, pode ser uma solução possível. O protocolo detalhado neste trabalho descreve a aplicação da terapia de phage contra a infecção por Pseudomonas aeruginosa em embriões de zebrafish CF. Os embriões de zebrafish foram infectados com P. aeruginosa para demonstrar que a terapia phage é eficaz contra infecções por P. aeruginosa, pois reduz a letalidade, a carga bacteriana e a resposta imune pró-inflamatória em embriões CF.
Introduction
A terapia phage, o uso dos inimigos naturais das bactérias para combater infecções bacterianas, está ganhando interesse renovado à medida que a resistência bacteriana aos antibióticos se torna generalizada1,,2. Esta terapia, utilizada há décadas na Europa Oriental, poderia ser considerada um tratamento complementar a antibióticos na cura de infecções pulmonares em pacientes com CF e uma possível alternativa terapêutica para pacientes infectados com bactérias resistentes a todos os antibióticos atualmente em uso2,,3. As vantagens da terapia antibiótico são que os bacteriófagos se multiplicam no local da infecção, enquanto os antibióticos são metabolizados e eliminados do corpo4,,5. De fato, a administração de coquetéis de phages virulentos isolados em diferentes laboratórios tem se mostrado eficaz no tratamento de infecções pseudomonas aeruginosa em modelos animais tão diferentes quanto insetos e mamíferos6,,7,,8. A terapia de phage também mostrou-se capaz de reduzir a carga bacteriana em feridas de queimadura infectadas com P. aeruginosa e Escherichia coli em um ensaio clínico randomizado9.
O zebrafish (Danio rerio) emergiu recentemente como um modelo valioso para estudar infecções com vários patógenos, incluindo P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus e Burkolderia cepacia12,13. Ao microinjetar bactérias diretamente na circulação sanguínea do embrião14 é fácil estabelecer uma infecção sistêmica que é neutralizada pelo sistema imunológico inato de zebrafish, que é conservado evolutivo com neutrófilos e geração de macrófagos semelhante à contraparte humana. Além disso, durante o primeiro mês de vida, os embriões de zebrafish carecem da resposta imune adaptativa, tornando-os modelos ideais para estudar a imunidade inata, que é o mecanismo crítico de defesa em infecções pulmonares humanas15. O zebrafish surgiu recentemente como um poderoso sistema de modelo genético para entender melhor o início da CF e desenvolver novos tratamentos farmacológicos10,,16,17. O modelo de zebrafish CF de cftr knock-down gerado com injeção de morfolino em zebrafish apresentou uma resposta de explosão respiratória amortecida e reduziu a migração de neutrófilo10, enquanto o nocaute do CFTR leva à posição do órgão interno prejudicada e à destruição do pâncreas exócrino, um fenótipo que espelha a doença humana16,17. De maior interesse foi a constatação de que a carga bacteriana P. aeruginosa foi significativamente maior em embriões de perda de função cftrdo que em controles em 8 horas pós-infecção (hpi), o que paralelamente aos resultados obtidos com camundongos e células epiteliais brônquias humanas2,,18.
Neste trabalho, demonstramos que a terapia de phage é eficaz contra infecções por P. aeruginosa em embriões de zebrafish.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste manuscrito, descrevemos o protocolo para realizar a infecção por P. aeruginosa (PAO1) em embriões de zebrafish e como aplicar a terapia de phage com um coquetel de phages previamente identificado como capaz de infectar PAO1 para resolvê-lo. O uso de bacteriófagos como alternativa aos tratamentos com antibióticos tem sido de crescente interesse desde os últimos anos. Isso se deve principalmente à difusão de infecções bacterianas multidrogas resistentes (MDR), que constituem um problema sério par…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Italiana de Fibrose Cística (FFC#22/2017; Associazione “Gli amici della Ritty” Casnigo e FFC#23/2019; Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus).
Materials
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
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