Phage Therapy Anwendung gegen Pseudomonas aeruginosa Infektion bei Mukoviszidose Zebrafisch Embryonen
Summary
Präsentiert hier ist ein Protokoll für Pseudomonas aeruginosa Infektion und Phagentherapie Anwendung bei Mukoviszidose (CF) Zebrafisch-Embryonen.
Abstract
Antimikrobielle Resistenzen, eine wichtige Folge diagnostischer Unsicherheit und antimikrobieller Überverschreibung, sind eine zunehmend anerkannte Ursache für schwere Infektionen, Komplikationen und Sterblichkeit weltweit mit enormen Auswirkungen auf unsere Gesellschaft und das Gesundheitssystem. Insbesondere Patienten mit geschwächtem Immunsystem oder bereits bestehenden und chronischen Pathologien, wie Zwiespäitische Fibrose (CF), werden häufigen Antibiotikabehandlungen unterzogen, um die Infektionen mit dem Auftreten und der Diffusion multiresistenter Isolate zu kontrollieren. Daher ist es dringend notwendig, alternative Therapien anzugehen, um bakteriellen Infektionen entgegenzuwirken. Die Verwendung von Bakteriophagen, den natürlichen Feinden von Bakterien, kann eine mögliche Lösung sein. Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll beschreibt die Anwendung der Phagentherapie gegen Pseudomonas aeruginosa Infektion bei CF-Zebrafischembryonen. Zebrafisch-Embryonen wurden mit P. aeruginosa infiziert, um zu zeigen, dass die Phagentherapie gegen P. aeruginosa-Infektionen wirksam ist, da sie Dielealität, bakterielle Belastung und pro-entzündliche Immunantwort bei CF-Embryonen reduziert.
Introduction
Phage-Therapie, die Verwendung der natürlichen Feinde von Bakterien, um bakterielle Infektionen zu bekämpfen, gewinnt neues Interesse als bakterielle Resistenz gegen Antibiotika wird weit verbreitet1,2. Diese Therapie, die seit Jahrzehnten in Osteuropa verwendet wird, könnte als eine ergänzende Behandlung von Antibiotika bei der Heilung von Lungeninfektionen bei Patienten mit CF und als mögliche therapeutische Alternative für Patienten mit Bakterien, die gegen alle derzeit verwendeten Antibiotika2 ,,3. Vorteile der Antibiotikatherapie sind, dass sich Bakteriophagen an der Infektionsstelle vermehren, während Antibiotika metabolisiert und aus dem Körper eliminiert werden4,5. In der Tat hat sich die Verabreichung von Cocktails von virulenten Phagen, die in verschiedenen Laboratorien isoliert wurden, bei der Behandlung von Pseudomonas aeruginosa Infektionen in Tiermodellen, die so unterschiedlich sind wie Insekten und Säugetiere, als wirksamerwiesen.,7,8 Die Phage-Therapie war auch in der Lage, die bakterielle Belastung in Mitpfoten von P. aeruginosa und Escherichia coli infizierten Verbrennungswunden in einer randomisierten klinischen Studie zu reduzieren9.
Zebrafische (Danio rerio) hat sich vor kurzem als ein wertvolles Modell zur Untersuchung von Infektionen mit mehreren Krankheitserregern, einschließlich P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus und Burkolderia cepacia12,13. Durch die Mikroinjektion von Bakterien direkt in die Embryo-Blutzirkulation14 ist es einfach, eine systemische Infektion zu etablieren, die durch das angeborene Immunsystem des Zebrafisches entgegengewirkt wird, das evolutionär mit Neutrophilen und Makrophagenähnlichgeneration ähnlich dem menschlichen Pendant konserviert wird. Darüber hinaus fehlt zebrafischembryonen im ersten Lebensmonat die adaptive Immunantwort, was sie zu idealen Modellen für die Untersuchung der angeborenen Immunität macht, die der kritische Abwehrmechanismus bei menschlichen Lungeninfektionenist 15. Zebrafish hat sich vor kurzem als ein leistungsfähiges genetisches Modellsystem herausgebildet, um den CF-Beginn besser zu verstehen und neue pharmakologische Behandlungen zu entwickeln10,16,17. Das CF-Zebrafischmodell von cftr knock-down, das mit Morpholino-Injektion in Zebrafische erzeugt wurde, präsentierte eine gedämpfte Atemausbruchsreaktion und reduzierte Neutrophilenmigration10, während der cftr-Knock-out zu einer beeinträchtigten inneren Organposition und zur Zerstörung der exokrinen Bauchspeicheldrüse führt, einem Phänotyp, der die menschliche Krankheit widerspiegelt16,17. Von größtem Interesse war die Feststellung, dass die bakterielle Belastung von P. aeruginosa bei cftr-Funktionsverlust-Embryonen signifikant höher war als bei Kontrollen nach 8 Stunden nach der Infektion (hpi), was den Ergebnissen von Mäusen und menschlichen Bronchialepithelzellen2,18entspricht. cftr
In dieser Arbeit zeigen wir, dass die Phagentherapie gegen P. aeruginosa Infektionen in Zebrafischembryonen wirksam ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Manuskript beschrieben wir das Protokoll zur Durchführung einer P. aeruginosa (PAO1) Infektion bei Zebrafischembryonen und wie man eine Phagentherapie mit einem Cocktail von Phagen anwenden kann, der zuvor als in der Lage identifiziert wurde, PAO1 zu infizieren, um es zu lösen. Die Verwendung von Bakteriophagen als Alternative zu Antibiotikabehandlungen ist seit einigen Jahren von wachsendem Interesse. Dies ist hauptsächlich auf die Verbreitung multiresistenter (MDR) bakterieller Infektionen zurück…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der italienischen Cystic Fibrosis Foundation (FFC-22/2017; Associazione “Gli amici della Ritty” Casnigo und FFC-23/2019; Un respiro in pié Onlus La Mano tesa Onlus).
Materials
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
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