JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

כיול ביצועים מיקרוקול MRM ושימוש הפגינו על שורשי truncatula Medicago ב 22 T

Published: January 16, 2021
doi:
10.3791/61266
, , , , , ,
1Solid-state NMR, Leiden Institute of Chemistry, Faculty of Science,Leiden University, 2Laboratory of Biophysics,Wageningen University & Research, 3Laboratory of BioNanoTechnology,Wageningen University & Research, 4MAGNEtic resonance Facility,Wageningen University & Research, 5C.J. Gorter Center for High Field MRI, Radiology department, Leiden University Medical Centre,Leiden University, 6Institute for Medical Physics and Biophysics,Leipzig University

Summary

פרוטוקול לחקר רקמות ביולוגיות ברזולוציה מרחבית גבוהה באמצעות מיקרוסקופ תהודה מגנטית שדה גבוה במיוחד (MRM) באמצעות קוסמים מוצג. הוראות שלב אחר שלב מסופקות לאפיון המיקרו-קוסים. לבסוף, אופטימיזציה של הדמיה מדגימה על שורשי צמחים.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר כיול יחס אות לרעש (SNR) ושיטת הכנה לדוגמה עבור מיקרו-סלילים סולנואידים בשילוב עם דגימות ביולוגיות, המיועדות להדמיית תהודה מגנטית (MRI) ברזולוציה גבוהה, המכונה גם מיקרוסקופית MR (MRM). זה יכול לשמש בספקטרומטרים MRI טרום קליני, הפגינו על דגימות שורש truncatula Medicago . מיקרו-קוסים מגבירים את הרגישות על-ידי התאמת גודל מהודה RF לגודל המדגם של עניין, ובכך מאפשרים רזולוציות תמונה גבוהות יותר בזמן נתון לרכישת נתונים. בשל העיצוב הפשוט יחסית, מיקרו-סלילים סולנואידים הם פשוטים וזולים לבנייה ותואם בקלות לדרישות המדגם. באופן שיטתי, אנו מסבירים כיצד לכייל מיקרו-קוסלים חדשים או ביתיים, באמצעות פתרון ייחוס. שלבי הכיול כוללים: קביעת כוח פולס באמצעות עקומת אגוזים; הערכת הומוגניות שדה RF; וחשב יחס אות לרעש מנורמל עוצמת קול (SNR) באמצעות רצפי פולסים סטנדרטיים. צעדים חשובים בהכנת מדגם לדגימות ביולוגיות קטנות נדונים, כמו גם גורמים מקלים אפשריים כגון הבדלים רגישות מגנטית. היישומים של סולנואיד ממוטב מדגימים על ידי ברזולוציה גבוהה (13 x 13 x 13 μm3, 2.2 pL) הדמיה תלת ממדית של מדגם שורש.

Introduction

הדמיית תהודה מגנטית היא כלי רב-תכליתי לתמונה לא פולשנית של מגוון רחב של דגימות ביולוגיות, החל מבניאדם ועד לתאים בודדים 1,2,3. בעוד סורקי MRI עבור יישומי הדמיה רפואית בדרך כלל להשתמש מגנטים עם כוח שדה של 1.5 T כדי 3 T, יישומים חד-תאיים הם תמונה בחוזקות שדהגבוהות הרבה יותר 1,3,4. המחקר של דגימות ברזולוציות מתחת למאה מיקרומטר מכונה מיקרוסקופ תהודה מגנטית (MRM)5. עם זאת, MRM סובל יחס אות לרעש נמוך (SNR) בהשוואה למיקרוסקופים זמינים אחרים או טכניקות הדמיה (למשל, מיקרוסקופ אופטי או CT). ניתן לנקוט במספר גישות כדי לייעל את SNR6. גישה אחת היא להשתמש בכוח שדה מגנטי גבוה יותר, בעוד גישה משלימה היא לייעל את גלאי האותות עבור דגימות בודדות. עבור האחרון, יש להתאים את ממדי הגלאי כך שהם תואמים לממדים של מדגם העניין. עבור דגימות קטנות בקוטר ≈0.5-2 מ”מ (למשל, רקמות שורש), מיקרו סלילים שימושיים כמו SNR הוא פרופורציונלי הפוך קוטר6,7. רזולוציות גבוהות ככל 7.8 x 7.8 x 15 μm3 הושגו על תאים בעלי חיים באמצעות microcoils ייעודי8. קיים מגוון סוגי מיקרו-סלילים, עם סלילים פלנריים וסולונואידים הנפוצים ביותר בהתאם לגיאומטריית היישום והרקמות9. סלילי תכנון בעלי רגישות גבוהה קרוב לפני השטח שלהם, דבר שימושי ליישומים על פרוסות דקות. לדוגמה, שיטה שתוכננה במיוחד עבור רקמת הדמיה סוטה תוארה עבור מיקרו-קוסילים מיכני10. עם זאת, סלילים מידרים יש נפילה גבוהה של רגישות ואין כוח פעימת התייחסות מוגדר היטב. סלילים סולנואידים, להיות גלילי, יש שטח רחב יותר של יישום והם מועדפים יותר עבור דגימות עבות יותר. כאן, אנו מתארים את המאפיינים של סולנואיד, פרוטוקול להכנת דגימות עבור MRI מיקרוקול, כמו גם את הכיול של מיקרוקול סולנואיד(איור 1A).

סיליל סולנואיד מורכב מחוט מוליך, כמו חולץ פקקים, סביב נמת שמחזיקה את הדגימה(איור 1B). ניתן לבנות מכללי מיקרוקול באמצעות חוט נחושת אמייל בלבד, מבחר קבלים, ובסיס מתאים להלחמה של הרכיבים(איור 1B). היתרונות העיקריים הם הפשטות והעלות הנמוכה, בשילוב עם מאפייני ביצועים טובים במונחים של נפח SNR ליחידהוהומוגניות שדה B1. קלות הבנייה מאפשרת איטרציה מהירה של עיצובי ים וגיאומטריות. הדרישות הספציפיות של עיצוב מיקרוקול סולנואיד ואפיון בדיקה (כלומר, התיאוריהשל אלקטרוניקה, מדידות שולחן עבודה, ומדידות ספקטרומטר עבור מגוון רחב של גיאומטריות סיליל)תוארו בהרחבה במקומות אחרים 7,11,12,13,14.

ניתן לבנות את סולנואיד על ידי מחשבה על כללי עיצוב עבור הממדים הרצויים על פי הקווים המנחיםהמתוארים במקום אחר 15,16. במקרה הספציפי הזה, נעשה שימוש בבול בקוטר פנימי של 1.5 מ”מ, עשוי מחוטי נחושת אמיילים, בקוטר 0.4 מ”מ, לולאה סביב נמש בקוטר חוץ של 1.5 מ”מ. סולנואיד זה מוחזק על לוח בסיס שבו מעגל מיוצר, המורכב קבל כוונון (2.5 pF), קבל תואם משתנה (1.5-6 pF) כמו גם נחושת חיבור חוטים(איור 1A, 1C). קבל הכיוון נבחר כדי להשיג את תדר התהודה הרצוי של 950 MHz, בעוד קבל התואם נבחר כדי להשיג את שידור האות המרבי במכשול של 50 אום. קבל גדול יותר משתנה כדי לאפשר כוונון מוכן יותר. בפעולה רגילה, כוונון והתאים מבוצעים באמצעות קבלים בבסיס הגשוש. המיקרו-קול המורכב צריך להיות מותקן על גשוש כדי שניתן יהיה להכניס אותו למגנט. ייתכן שיהיה צורך במחזיק נוסף, בהתאם למערכת. כאן אנו משתמשים בשילוב מגנט 22.3 T עם Bruker קונסולה Avance III HD בשילוב עם בדיקה Micro5. במקרה זה, השתמשנו בהוספה תמיכה שונה מצויד בחיבורים הדרושים כדי להתחבר ערוץ 1H של הגשוש (איור 1A).

העיצוב התואמת לרגישות של סליל כולל מאגר עם נוזל perfluorinated כדי להפחית אי התאמות רגישות, הנובע סליל נחושת להיות בסמיכותלדגימה 17. מאגר מים עשוי ממזרק פלסטיק כדי להקיף את הסליל ומלא בפלומבלין. כמו נוזל perfluorinated צריך להקיף את הבוליל, הקוטר הזמין עבור מדגם מצטמצם לקוטר החוצה של 1 מ”מ. כדי להקל על שינוי מדגם, המדגם הוכן נמת עם קוטר החוצה של 1 מ”מ וקוטר פנימי של 700 μm. הכלים הדרושים להכנת מדגם מוצגים באות 2A.

פרמטרי MR ניסיוניים בסיסיים תלויים מאוד בחומרת המערכת המשמשת, כולל מערכת הדרגתית, חוזק שדה ומסוף. ניתן להשתמש במספר פרמטרים לתיאור ביצועי המערכת, מהם אורך וחשמל של 90°, B1-homogeneity ו- SNR לכל אמצעי אחסון ליחידה (SNR/mm3), הםהרלוונטיים ביותר למעשה. SNR/mm3 שימושי להשוואה בין הביצועים של סלילים שונים באותה מערכת18. בעוד שקיימים הבדלי חומרה בין מערכות, היישום האחיד של פרוטוקול בחינת ביצועים מקל גם על השוואת ביצועי המערכת.

פרוטוקול זה מתמקד כיול והכנת מדגם. האפיון צעד צעד של הביצועים של מיקרוקולים סולנואידים מוצג: כיול 90 ° אורך הדופק או כוח; הערכת ההומוגניות של שדה RF; וחשב SNR לכל אמצעי אחסון יחידה (SNR/מ”מ3). מדידת ספין-הד מתוקן באמצעות פנטום מתוארת כדי להקל על השוואה של עיצובי סיליל, המאפשר אופטימיזציה של יישומים נפרדים. פנטום ודגימה ביולוגית דגימה הכנות, ספציפי עבור מיקרו קוסלים, מתוארים. הפרוטוקול יכול להיות מיושם על כל מגנט אנכי מתאים צר-נשא (≤60 מ”מ) מצויד במערכת הדמיה מיקרו זמינה מסחרית. עבור מערכות אחרות, הוא יכול לשמש קו מנחה ותו לא ניתן להשתמש בו עם כמה התאמות.

הכנת דגימה ביולוגית למדידות MRI היא בדרך כלל לא נרחבת מאוד מאז הדגימה הוא תמונה שלמה ככל האפשר. עם זאת, חללי אוויר ברקמה ביולוגית יכולים לגרום לחפצים של תמונה בשל הבדלים ברגישות מגנטית19. ההשפעה גדלה עם הגדלת כוח השדה המגנטי20. לכן, יש להימנע ממרחבים אוויריים בחוזקות שדה גבוהות, וזה עשוי לדרוש טבילה של הדגימה בנוזל כדי למנוע אוויר סביב הרקמה והסרת חללים אוויריים בתוך מבני הרקמות. באופן ספציפי, כאשר microcoils מועסקים, ניתן יהיה צורך בהתקעה של רקמת הדגימה הרצויה, ולאחר מכן להחלים אותו בנוזל מתאים. זה מלווה בהחדרת הדגימה לתוך נימות חתוכה מראש, ולבסוף לאטום את נימה עם שעוות נימות. שימוש בשעווה כחומר איטום במקום דבק, איטום להבה או חלופות, אומר כי הדגימה עשויה להיחלץ בקלות. הליך זה מדגים על השורש של truncatula Medicago, צמח קטניים קטן. יתרון של פרוטוקול זה הוא הפוטנציאל לרישום שותף הבא של נתוני MRI עם מיקרוסקופ אופטי, מאז המדגם אינו נהרס במהלך מדידת MRI.

הפרוטוקול המוצג מתאים לרזולוציה מרחבית גבוהה במדידות situ, ועיצובים משוכללים יותר עשויים לאפשר הדמיה בדגימות vivo, שם יש צורך לטפל באתגרים הקשורים למערכות תומכות חיים.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה מתאר הליכים לשימוש והערכה של מאפייני סיליל של 1.5 מ”מ קוטר פנימי (מזהה) סולנואיד(איור 1). הסליל המשמש להדגמת הפרוטוקול שותר במאגר תואם לרגישות, אך הפרוטוקול ישים באותה מידה לסלילים שאין שני להם. הפרוטוקול עשוי להיות מותאם לגדלים אחרים ותכונות ספקטרומטר שונות. 1. הכנת מדגם עיון כדי להכין 100 מ”ל של פתרון התייחסות רגישות, להמיס 156.4 מ”ג של CuSO4 ∙ 5 H2O לתוך 80 מ”ל של D2O הכלול בקבוקון GL45 100 מ”ל. סולפט הנחושת מפחית את זמןההרפיה T1 ו-T2, ומאפשר מדידות מהירות יותר, בעוד שה-D2O מונע השפעות של שיכוך קרינה ורוויה. מערבבים באופן ידני עד שהמוצקים נמסים לחלוטין. כוונן את עוצמת הקול ל- 100 מ”ל באמצעות מים deionized עבור ריכוז סופי של 1 גרם/L CuSO4 (anhydrous, 6.3 מ’). ריכוז זה מספיק כדי לקצר T1 ו T2 הרפיה אבל לא גבוה מדי כדי להיות מושפע על ידי משקעים. אטום את דגימת ההפניה כדי למנוע שינוי היחס של H2O: D2O. לחלופין, חבר את הגשוש למנתח רשת, כדי לבדוק אם הבוליל מהדהד בתדר התהודה הרצוי. בצע בדיקת השתקפות S11 כדי למדוד את טווח התדרים שהושג על ידי כוונון ועל מדידות Q-פקטור כמתואר בפירוט על ידי האסה ואח’14. חבר את המיקרו-קוסם למנתח הרשת באמצעות כבל סיסי משותף. השתמש בכבלים מתאם BNC במידת הצורך. הגדר את תדר המרכז במנתח הרשת לתדר התהודה הרצוי, בהתאם לעוצמת השדה המגנטי המיועד שעבורו מתוכנן ההסל. לאחר מכן, הגדר את רוחב הסריקה ל- 10 MHz. כוונן את קבל המשתנה במכלול המיקרו-קוסם, אם קיים, לכוונן את מטבל הרפלק-השתקפות לתדר הרצוי. רמת את רמת ההשתקפות בתדר המרכזי ואת התדירות f1 ו- f2 ברמת -7 dB. השתמש אלה כדי לחשב את Q-פקטור ברמת -7 dB על פי האסה ואח’14 2. הכנת מדגם אם מכינים מדגם ייחוס לכיול סיליל, העבר פתרון 1 מ”ל של CuSO4 לצלחת זכוכית שעון תחת סטריאומיקרוסקופ. אם מכינים דגימה ביולוגית, להעביר 1 מל של perfluorodecalin (PFD) לתוך שעון תחת stereomicroscope, אשר ישמש כדי לשקוע הדגימה. PFD משמש כפי שהוא יכול למלא חללים אוויריים בדגימה, מבלי להיכנס לתאים ביולוגיים. זה גם לא נצפה על ידי MRI פרוטון. מכסים מיד את השעון במכסה צלחת פטרי כדי למנוע אובדן אידוי, לפני שיש צורך ב-PFD.הערה: PFD הוא נדיף מאוד וגז חממה חזק לטווח ארוך21. כאשר תכונות המסת החמצן שלה צמיגות נמוכה שלה אינם נדרשים, זה יכול להיות מוחלף עם Fomblin, perfluoroether אשר גם נותן שום אות 1H נצפה, אבל אשר אינו מתאדהמהר 17. חותכים נימים בקוטר חוץ מתאים לגודל, כדי להתאים בתוך הקוטר של מחזיק מיקרוקול (18 מ”מ) ולאפשר מיקום מחדש(איור 1C). השתמשו בחותך קרמיקה כדי לבצע חתך כל 10-12 מ”מ ולשבור בזהירות על נקודת החתך. אם מכינים דגימת התייחסות, השתמש פינצטה ו stereomicroscope כדי להביא נימות מראש לחתוך במגע עם פני השטח של פתרון CuSO4 בתוך זכוכית השעון, המאפשר פעולה נמת למלא את נימות. אם מכינים דגימה ביולוגית, השתמש בפינצטה ובסטריאומיקרוסקופ, כדי להביא נימות חתוכה מראש במגע עם פני השטח של PFD בתוך זכוכית השעון, ומאפשר לפעולה נמת למלא את נימה באופן מלא. שחררו את הנמת לתוך זכוכית השעון כך שהוא יהיה שקוע לחלוטין. בזהירות לחלץ מערכת שורש שלמה בת חמישה שבועות ממצע הצמיחה שלה, כגון החלפת קרקע perlite. נקה את דגימת השורש בקפדנות של ריזושה. הסר חלקיקי אדמה גדולים באמצעות פינצטה, ואם קיימים חלקיקים קטנים יותר, הסר אותם על ידי שטיפת מערכת השורשים עם מים מזוקקים. צילום במידת הצורך לעיון עתידי. בחר ולעקור קטע קטן של שורש סיבי ללא rhizosheath באמצעות אזמל. לטיפול בוואקום, מקם את הדגימה בצינור של 1.5 מ”ל המכיל פתרון קיבעון מתאים. השאר את מכסה הצינור כבוי, ולאחר מכן לאטום את הצינור עם parafilm כדי לאטום את פתיחת הצינור. לאחר מכן, חורים ניקוב בסרט עם כלי חד כדי לאפשר אוורור של הצינור. מניחים את צינור הדגימה בתא ואקום, לאטום את התא, ולחבר משאבת ואקום קרום מעבדה לתא. לחשוף את הדגימה לטיפול ואקום עד 30 דקות, כדי להפחית את הנוכחות של כיסי אוויר בתוך דגימות ביולוגיות. לעצור את הטיפול ואקום כאשר אין בועות אוויר נראים לברוח הדגימה. תוך כדי הסתכלות דרך סטריאומיקרוסקופ, להשתמש פינצטה כדי לשקוע הדגימה במדיום החדירה הוכן בעבר. שטוף את הדגימה של פסולת פוטנציאלית. הכנס את הדגימה לתוך הנימות באמצעות פינצטה, בעוד הנימות והדגימה שקועים במלואם כדי למנוע הכללה של בועות אוויר. השתמש קצה מחט נמש קטן יותר או מזרק כמו מוט דוחף(איור 2B). קח את נמת הדגימה מזכוכית השעון הבינונית, באמצעות פינצטה. במקרה של PFD, לכסות את מכסה צלחת פטרי. מעצבים את נייר הטישו לנקודה עדינה ולהשתמש בו כדי להסיר בסביבות 1 מ”מ של נוזל משני קצות הנימות. ממיסים נפח קטן של שעוות נכים באמצעות עט שעווה. למרוח שעווה על שני הצדדים. השעווה תהפוך אטומה כשהיא תתגבש. הקפד להוציא בועות אוויר מן הנתים(איור 2C).הערה: הימנע שעווה התחממות יתר או נימי כמו זה עלול לגרום לרתיחה נפץ, כמו גם כיסי קביטציה כאשר המדגם סיים מתקרר. לאחר מכן, לגרד שעווה עודפת מהחיצוני של נכי באמצעות אזמל ולנגב נקי עם נייר טישו דק. 3. הרכבת המדגם מניחים חיידק מתחת לסטריאומיקרוסקופ והכנסו את הדגימה באמצעות פינצטה תוך שמירה על מיקרוסקופ יציב(איור 2D). השתמש במוט כדי למרכז את הדגימה במיקרו-קוסקוס, על ידי החלקת נמת בתוך סולנואיד. לחלופין, החל סרט דבק כדי לתקן את מיקום הניים. בדוק את הנימות כדי לוודא שלא בועות אוויר נראות בתוך סיליל סולנואיד, כדי למנוע הרס אות MR שנגרם על ידי הבדלי רגישות. חבר את המיקרו-סיסל לשקע של בסיס הגשוש, תוך שמירה על המיקרו-סיסיל זקוף(איור 3A,3B). החלק בזהירות את סלילי השסע המשולשים מעל המיקרו-סליל תוך התאמת מחברי קירור המים של מעבר הצבע לזה של בסיס הגשוש(איור 3C). הפעל את חוט הברגים בבסיס הגשוש כדי לתקן את מעבר הצבע במקומו.הערה: שלב זה חל על בדיקה Micro5 בלבד. במקרה של מערכות אחרות כגון Micro2.5 או Biospect, מעברי הצבע נמצאים בשקע נפרד מאשר בסליל. 4. קביעת מאפייני סיליל אם סליל נבדק בפעם הראשונה, השתמש בפתרון מדגם ההפניה כדי ליצור מדגם הומוגני, שימושי לכיול צריכת חשמל ובדיקות הומוגניות B1. בעיות רגישות פוטנציאליות בשל חוטי הבוליל עשויים להיבדק בקלות עם מדגם הפניה זה. הכנס את הגשוש למגנט וחבר את הכבלים הדרושים: כבל שידור/קבלה של RF, קווי קירור מים, כבל תרמוקופל וקו קירור אוויר. הגדר את טמפרטורת קירור המים הרצויה (מומלץ 298 K) עבור יחידת קירור המים. הגדר את טמפרטורת היעד (298 K) ואת זרימת גז היעד (300 L/h). זרימת הגז עשויה להיות שונה עבור עיצוב סיליל שונה או נפח מדגם. הדבר חל רק על מערכות עם מערכת בקרת טמפרטורה.הערה: השלבים הבאים נחוצים רק בעת בדיקת סלילים חדשניים (ביתיים). חבר את הגשוש באמצעות כבל Ω-50 תקרה משותף למנתח רשת עם רוחב סריקה רחב מתאים (400 MHz), הממורכז בתדר התהודה המיועד. שים לב למצבי התהודה על-ידי התאמת קבלי ההתאמה והכוונון המשתנים הנוכחים בבסיס הגשוש. כוונן והתאים את מצב התהודה לתדר הרצוי. לחלופין, לקבוע את מקדם איכות הבוליל (Q-factor) של מנתח הרשת. שיטה אחת כדי להשיג את גורם האיכות היא להשתמש ברשת צימוד וחלוקת תדר המרכז (fc) ברוחב של טבילה השתקפות ב -7 dB (כלומר, Q = f=( f1 – f2)14. הגדר fc לתדר ההפעלה של המגנט, בעוד f1 ו- f2 מוגדרים לנקודת -7 dB שמאלה ומימין של fc, בהתאמה. מנתחי רשת מסוימים כוללים קביעת Q-factor מובנית. התחל בדיקת רעיוני אור בסורק, הנקראת בדרך כלל עקומת מתנדנדת, והתאימה את כוונון והתאמתם במידת הצורך. מומלץ להגדיר את כל קבלי כוונון והתאים לנקודת האמצע של הטווח שלהם עבור סלילים חדשים. לכן, התחל עם רוחב ניקוי ספקטרלי גבוה. במקרים מסוימים, זה עשוי להיות נוח יותר לכוונן ולהתאים את הבוליל מחוץ למגנט במנתח רשת. בחר קובץ shim עבור תסיל אמצעי האחסון הגדול ביותר של גשושית ההדמיה אם הוא זמין. אם נתחיל מסיליל שהיה בשימוש בעבר, השתמש בקובץ shim זמין. אם שתי האפשרויות אינן זמינות, התחל עם כל ערכי shim מוגדרים כ- 0. בחר את תצורת הבוליל הנכונה עבור המיקרו-קוסם אם הוא זמין בתוכנת ההדמיה (כלומר,ParaVision). אחרת, צור תצורת סיליל חדשה התואמת למפרטים של הסיל (לדוגמה, מכוון יחיד או מכוון פעמיים) בהתאם למדריך המערכת. הערכות עבור המגבלות הבטוחות עבור מיקרוקול סולנואיד זה בשימוש במחקר זה עם 1.5 מ”מ קוטר פנימי בגודל הוא 1 ms ב 1 W כוח שיא ו 1 mW כוח רציף.התראה: קבלים קטנים (בדרך כלל 1 מ”מ בגודל) הדרושים microcoils רגישים מאוד ונפגעים בקלות על ידי מתחים גבוהים. קביעת כוח פולס אוטומטית עשויה שלא לתפקד עם סלילים לא סטנדרטיים, וסמכויות גבוהות מדי עלולות לגרום נזק לסלין או לחלקים אחרים של הספקטרומטר. לכן, מומלץ להתאמות ידניות. להקליט עקומת אגוזים עבור סיליל חדש כדי לקבל אינדיקציה של כוח RF הנכון עבור הבוליל (איור 4). במקרה המגבלות הבטוחות עבור הבוליל אינם ידועים, להתחיל עם 10 μs בהפעימה נמוכה של 0.6 W ולהגדיל לאט את אורכי הדופק על ידי 1 μs בכל פעם עד האות מופיע. באמצעות ניסוי FID בהיעדר קידוד הדרגתי, לשנות את אורך פעימת RF באופן שיטתי תוך שמירה על כוח הדופק קבוע. אורך הדופק האידיאלי הוא אורך הדופק, שבו עוצמת האות מגיעה למקסימום. אם בדיקת סיליל חדש, השתמשו בפולס של 10 μs עם הספק נמוך מאוד תחילה והתחילו להגדיל את כוח הדופק בהדרגה.הערה: במקרה שהחשמל גבוה בהרבה מהצפוי עבור השילוב של מאפייני סיליל וספקטרומטר, זוהי כבר אינדיקציה לכך שאפשרות מצב תהודה שגוי נבחר. עבור סליל עם שדה B1הומוגני, כמו סליל סולנואיד, לקבוע את הדופק 180° שבו עוצמת האות יורד לאפס22. הגדר את כוח הדופק שנקבע 90° לתוך כרטיס ההתאמה של המחקר שנוצר. ב- ParaVision, ניתן להשתמש בכרטיס התאמת צריכת החשמל של ההפניה כדי להזין את כוח הדופק הקשה. השתמש בסריקת localizer עם 3 פרוסות, פרוסה אחת בכל אחד משלושת הצירים הראשיים, כדי לאתר את מיקום סליל בתוך המגנט. כך, טען סריקת מיזרים מקומיים מספריית ברירת המחדל של הספקטרומטר. מומלץ להתחיל בשדה תצוגה גדול ללא היסט. בצע כוונון רכש אוטומטי של מקלט והתחיל את המדידה באופן ידני.הערה: אם הדגימה נמצאת בדיוק במרכז מערכת מעבר הצבע, סריקת ה-localizer תדגים את הדגימה. אם סליל או דוגמה אינם מרוכזים בפרוסות התמונה או חסר, יש לכוונן את סריקת localizer, במקרה זה שלב 4.12 יש לבצע שוב. לחלופין, השתמש בדרך משלימה כדי למצוא את הדופק הנכון של 90° בהתבסס על הערכת תמונה. לאחר שכוח דופק משוער נמצא באמצעות עקומת האגוז, התאם את כוחות הדופק בהדרגה כדי לבדוק את התמונה עבור הומוגניות שדה B1. עבור סלילי סלילים מסוימים עם שדה B1 לאהומוגני, כוח הדופק 90° שנקבע באמצעות עקומת האגוזים עשוי להיות מוערך יתר על המידה, מה שמוביל להגזמה במקום המתוק הרצוי של סליל. במקרה זה, להפחית את כוח פעימת ההפניה ולבדוק את התמונות החדשות מול התמונות הקודמות (איור 5). באופן ידני לתפור את השדה המגנטי בהתבסס על אות FID. הזמנה מומלצת לשימינג ראשוני היא Z-Z2-Z-X-Y-Z-Z2-Z-XY-XZ-YZ-Z. במקרה של סולנואיד, ציר הסימטריה הראשי נמצא במטוס ה-XY. לכן, shims לכיוונים שונים עלול לגרום לתיקון חזק יותר של הומוגניות B0 עבור תצורת סליל זו. לשימסים בסדר גבוה יותר אין השפעה רבה ותתעלמו מהם. חשב SNR מנורמל אמצעי אחסון כדי לאפשר השוואה של מאפייני מיקרו-קוסם על פני מערכות שונות, מותאם פרוטוקול של היצרן18. עבור מיקרו-קוסלים המשמשים כאן, השתמשנו ברצף ספין-הד עם הפרמטרים הבאים: שדה תצוגה (FOV) 6 מ”מ x 6 מ”מ, זמן חזרה (TR) 1000 אלפיות השנייה, זמן הד (TE) 7 אלפיות השנייה, מטריקס 256 x 256 ועובי פרוסה = 0.5 מ”מ. כוונן את עובי הפרוסה עד שהרווח של המקלט יהיה יוניטרי. לאחר מכן, התאם את מספר הפרוסות כך שהפרוסות יתרחבו מעבר לאזור ההומוגניותשל שדה B1. להקליט את התמונות ללא אות בממוצע, אם אפשר. קבע את אמצעי האחסון המנורמל SNR (SNR/mm3)בשני שלבים. תחילה, חשב את אמצעי האחסוןvoxel ( Vvoxel)(Eq. 1):(1)הערה: היחידות עבור Dx, Dy ופרוסת Dהן במ”מ. ניתן לבצע חישוב זה גם עבור סידרה של פרוסות. בחר את אזורי העניין כדי לקבוע את עוצמת האות ( μ ROI ) שלהדגימה,ואת עוצמתהאות (μרעש) ואת סטיית התקן (σרעש) לאזור מחוץ לדוגמה (כלומר, הרעש). האות אומר נלקח ממרכז התמונה, בעוד אות הרעש מחושב מהתיקונים הפינתיים (איור 6). תוכנת בקרת ספקטרומטר או תוכנת עיבוד תמונה לשימוש כללי עשויים לשמש עבור חישובים אלה. השתמשו בחזרה אחת במידת האפשר, כדי לשמור על השוואה בין סלילים שונים. השתמש בערכים כדי לחשב SNR מנורמל אמצעי אחסון (Eq. 2):(2)עבור הבוליל המשמש כאן בשילוב עם פתרון ההפניה, באמצעות Eq. 2 תוצאות הפתרון הבא:(3)הערה: בעת השוואת SNR של סלילים בחוזקות שדה מגנטי שונות, תכונות ההרפיה של פנטום צריך להימדד23, אלא אם כן זמן חזרה ארוך מאוד זמן הד קצר מאוד משמשים. בדוק אם יש בעיות רגישות עקב בעיות שדה מגנטי: לטעון ולהפעיל רצף מרובה של מעבר צבע-אקו (MGE)(איור 7). תמורות שדה מגנטי בשל הבדלי רגישות גלויים בתמונות עם זמני הד ארוכים יותר, כמו הד הדרגתי אינו ממקד מחדש ספינים, אשר dephase עקב inhomogeneities שדה סטטי. בדרך זו, inhomogeneities בדגימה ניתן לדמיין (בשל מרחבי אוויר בדגימה), כמו גם B0 שדה inhomogeneities הציג על ידי חומר סליל. השתמש בפרמטרים הבאים, כדי להיות מותאם בהתאם למפרטים של ספקטרומטר וcoil בשימוש: TR 200 ms, TE 3.5 ms עם 48 הדים רווחים 3.5 שניות שנייה זה מזה, להפוך זווית 30 מעלות. גודל מטריקס 128 x 128.הערה: אם נצפו מצבים מהדהדים (פוטנציאליים) או מטבלי השתקפות בעקומה התהודה (מתנדנד), חזור על השלבים לעיל עבור כל מצב מהדהד כדי לקבוע את המצב הרגיש ביותר. בהתאם למיקרו-קוסקוס, חלקים שונים של מכלול המיקרו-סיל עשויים להיות מועדים למצבי תהודה לא מכוונים. 5. הדמיה ברזולוציה גבוהה הפעל ניסוי תלת-מד-FLASH עם הפרמטרים הבאים: TR 70 ms, TE 2.5 אלפיות השנייה, גודל מטריצה של 128 x 64 x 64, FOV 1.6 x 0.8 x 0.8 מ”מ, זווית היפוך של 30°, ורוחב פס של 50 kHz של מקלט. להפיק את כוחות הדופק מ כוח פעימת ההתייחסות שנקבע קודם לכן; באופן אוטומטי ברוב תוכנות ההדמיה. קבע את רווח המקלט באמצעות התאמות אוטומטיות. התאם את ה-FOV במידת הצורך, וכיסה את האובייקט כולו בשני הכיוונים של קידוד השלבים כדי להימנע מהחלת כינוי. הפעל הדמיית מחזור עבודה הדרגתי, אם היא זמינה במערכת, כדי לוודא שמחזור החובה של הניסוי נשאר במפרטים של סלילי השחזור.הערה: פרמטרים אלה ספציפיים לבוליל המשמש להדגמה; חשוב למטב לפרטי המערכת המקומית. 6. שחזור דגימות למחקר נוסף או אחסון הסר את נמת הדגימה מהמיקרו-קוסקוס. בעזרת פינצטה, הסר את אטמי השעווה מתחת לסטריאומיקרוסקופ. השתמש במזרק כדי לשטוף את הדגימה מתוך נמת עם פתרון של בחירה. לחלופין, השתמש במוט דוחף זכוכית כדי לפלוט את הדגימה. כדי למנוע התייבשות של הדגימה, יש לאחסן במדיום מתאים לאחסון.

Representative Results

אפיון סילילעם כוונון והתאים מוצלחים של אסיל, ביצועיו עשויים להיות מאופיינים ב-Q-factor של 90° ו-SNR/mm3. עבור 1.5 מ”מ מזהה רגישות התאם סולנואיד coil הדגימה כאן, Q-פקטור נמדד (פורק) היה 244, לעומת 561 עבור 5 מ”מ כלוב ציפורים. ההפניה 90° דופק היה 12 μs ברמת כוח של 0.6 W; cf. 5 μs ב 45 W עבור 5 מ”מ כלוב כלוב ים (איור 4 ו איור 5). זה משווה לעוצמת שדה פולס RF (B1), באמצעות 0.53 mT עבור מיקרוקול ו 1.17 mT עבור 14 coilכלוב הציפורים שבו y הוא היחס gyromagnetic, בעוד טאו הוא משך הדופק. מכיוון שרמות כוחהדופק (P)שונות, ניתן להשוות את הסלילים במונחים של יעילות שידור : 0.69 mT/W1/2 ו- 0.18 mT/W1/2 עבור מיקרו-סליל וכלובהציפורים בהתאמה 14. בהשוואה לפעימה של 90 מעלות, המיקרו-פתיל נמצא כגורם ≈ פי 4 יותר רגיש מסיליל כלוב הציפורים. השפעת התאמת הרגישותבחוזקות שדה גבוהות במיוחד, הדגימה והרגישות לסיליל הופכות לגורם דומיננטי באיכות התמונה, כפי שניתן לראות באות 7A,7B. בהשוואה סליל חסר רגישות תואמת מאגר נוזלים, האות נשמר ארוך יותר הומוגני יותר בדגימה התייחסות. עם זאת, בשל המאגר הרגיש, ממד המדגם המרבי להקטין ביחס לסלל ללא המאגר. הדמיה ברזולוציה גבוההרזולוציה גבוהה של 13 x 13 x 13 μm3 של דגימת שורש Truncatula Medicago הושגה בתוך 20 שעות ו 23 דקות(איור 8). החל מפני השטח של השורש, קליפת השורש נראית, יחד עם כמה מים שיורית בצד החיצוני של השורש. יתר על כן, xylem נצפה כלהקה כהה המקיף את הפלוטם. כיסי אוויר מסוימים נצפים ככתמים כהים עם אובדן אותות מוחלט. ניתן גם למצוא את המוסתים הסימביוטיים של M. truncatula באמצעות פרוטוקול זה (איור 9). באמצעות קצת גדול יותר בלין ללא תחרות (אורך בסביבות 3500 μm, קוטר פנימי 1500 μm), תמונות עם רזולוציה של עד 16 x 16 x 16 μm3 הושגו ב 33 דקות. איור 1: מיקרו-קוסקוס סולנואיד. (א)עיצוב סולנואידים מורכב חוט לולאה helly, בדרך כלל כרוך סביב נמת. הגיאומטריה של החוט, כגון עוביו, קוטרו, מספר המתפתלים והמרווח בין התילים, משפיעה על מאפייני הבוליל. (ב)מיקרו-קוסם סולנואיד ביתי עם מאגר לרגישות של נוזלים תואמים (פומבלין). הוא מורכב מפצע חוט נחושת מצופה 0.4 מ”מ שש פעמים סביב נמש עם קוטר חוץ של 1500 μm ואורך סיליל של 3500 μm. הבוליל שקוע במאגר מים עשוי ממזרק. ניתן להוסיף נימים לדוגמה בקוטר החוצה של 1000 μm. נעשה שימוש בשני קבלים, קבל של 1.5 pF בסדרה עם השרן וקבל משתנה שני של 1.5-6 pF ממוקם במקביל למשרן. כל הרכיבים הלחמה ללוח פיברגלס (צהוב). הוא מותקן על בעל מסחרי (פולימר אפור) ששונה כדי לתמוך במאגר.  (ג)רכיבי עיצוב סולנואידים: 1. סולנואיד, 2. נמת דגימה, 3. 1.5 pF קבל כוונון, 4. קבל תואם משתנה, 5. פיברגלס בסיס לוח, 6. חוט נחושת מוביל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 2: הכנה לדוגמה תחת סטריאומיקרוסקופ. (א)פריטים הדרושים להכנת מיקרו-קוסלים. משמאל לימין: 1. פתרון ייחוס CuSO4, 2. פרפלואורודקלין, 3. מיקרו-קוסם, 4. אזמל, 5. פינצטה מתח חיובי, 6. פינצטה, שבע. נימים בקוטר החוצה = 1000 μm, 8. עט שעווה, 9. שעוות נים, 10. כפפות ניצן, 11. סטריאומיקרוסקופ, 12. שעון זכוכית עם כיסוי צלחת פטרי, 13. חומר צמחי בצוללת צמיחה. לא מוצג: מזרק 2 מ”ל עם מחט ø 0.8 x 40 מ”מ ונייר טישו משובח. (ב)תקריב של הכנסת דגימה לתוך נימות באמצעות פינצטה, בעוד שניהם נשמרים שקועים. (ג)איטום של נמת באמצעות שעווה מותכת. הכנסתנמת המיקרו-קוסם המוכנה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: הרכיב של גשוש מיקרו-הדמיה. (A) בסיס בדיקה Micro5, המכיל את כל החיבורים הדרושים לקירור מים, חימום, חיישני טמפרטורה, כוח הדרגתי, RF (מחבר co-axial גלוי) וזיהוי בדיקה אופציונלי (PICS). מתחת לבסיס הגשוש יש ידיות המאפשרות התאמת קבלי כוונון ותואם משתנים, כמו גם ברגים שומרים כדי להחזיק את הגשוש במקומו בתוך הספקטרומטר. (ב)מיקרו-פקל ביתי המותנה על גבי בסיס הגשוש. שים לב קבלים משתנה (קרמיקה לבנה) רכוב על בסיס בדיקה המאפשרים כוונון והתאים. (ג)הדרגתי משולב בעל 3-axial המותקן על בסיס הגשוש עם כלי קיבול לקירור מים ומגעים מצופה זהב להארקת מעבר הצבע. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 4: עקומת אגוזים. עקומת אגוז נרכשת כדי לקבוע את כוח פעימת ההפניה. כוח פעימת ההפניה (90° pulse) מוגדר כשילוב של כוח ואורך דופק הדרושים ליצירת שדה B1 שהופך את כל המגנטיזציה הזמינה בכיוון z למטוס הרוחבי. סדרה של דופק נרשמת בהיעדר קידוד הדרגתי. עם כל פעימה, אורך הדופק או כוח הדופק הוא מצטבר. כאן כוח הדופק מוגדר 0.6 W, בעוד אורך הדופק הוא מצטבר על ידי 1 μs בכל פעם. עוצמת האות המרבית מצביעה על פעימה של 90°, בסביבות 12 μs. הדופק 180° יכול להיקבע גם בדרך זו באמצעות העוצמה המינימלית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 5: הגדרה חזותית של כוח דופק של 90°. לאחר שכוח פעימת התייחסות משוער נמצא באמצעות עקומת אגוז, זה יכול להיבדק חזותית על ידי שינוי אורך הדופק. בהתאם לבוליל, השדה B1 עשוי להיות פחות או יותר רגיש לשינויים. אורךדופק של 11 μs. (ב)12 μs אורך דופק, אופטימלי עבור סיליל זה. אורךדופק של 13 μs. אורךדופק של 20 μs. אם עוצמת הדופק מוגדרת גבוהה מדי, עלולה להתרחש הטיית יתר, ובכך להפחית את עוצמת התמונה במרכז סליל (ראש החץ). שדה B1 המוגבר מגדיל גם את טווח הגליל, כפי שניתן לצפות ברוחב התמונה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 6: אזור עניין. ניתן לראות את אזורי העניין (ROI) עבור חישוב SNR מנורמל של אמצעי האחסון. עוצמת המדגם ממוצע נלקח תשואה על ההשקעה כי נופל בתוך מדגם פתרון ההפניה. הרעש ו סטיית התקן הרגילים מחושבים מ-ROI אחד או יותר הממוקם בפינות התמונה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 7: הומוגניות RF המוערכת על-ידי הדמיית הד הדרגתית. רצף הד הדרגתי מרובה (MGE) משמש להערכת הומוגניות RF (B1-Field) באמצעות סידרה של הדים הדרגתיים. פרמטרים בסיסיים היו: זמן חזרה 200 ms, זמן הד 3.5 ms עם מספר הדים 48, אקו מרווח 3.5 ms, 64 ממוצעים, זמן רכישה 27 m 18 s, להעיף זווית 30 °. שדה התצוגה היה 5 x 5 מ”מ, מטריצה 128 x 128, רזולוציה 39 x 39 x 200 μm. (A) התאם לרגישות. הנוזל התואם הרגישות (Fomblin) המקיף את RF coilils מפחית את השפעות הרגישות בשל חוט הבוליל. בועות אוויר קטנות גורמות לאובדן אות ככל שזמן ההד גדל. (ב)אסלין (לא רגישות תואמת) בקוטר סיליל שווה. בזמנים ארוכים יותר של הד, חפצים גוברים הנגרמים על ידי B0 inhomogeneity שדה נצפו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 8: הדמיה תלת-ממדית של מקטע שורש של תות-ן של מדיקאגולה. תמונתפלאש. ניתן להבחין במספר תכונות של מקטע השורש, כולל האפידרמיס (e), קליפת המוח (c), phloem (ph) ו xylem (xy). כיסי אוויר (א) בשורש גורמים לאובדן אותות מוחלט. פרמטרים בסיסיים היו כדלקמן: זמן חזרה 70 ms, זמן הד 2.5 ms, 256 ממוצעים, זמן רכישה 20 שעות 23 מ ‘. רזולוציה 13 x 13 x 13 μm3. גודל מטריצה היה 128 x 64 x 64 ושדה תצוגה 1.6 x 0.8 x 0.8 מ”מ. רוחב פס של מקלט 50 kHz. (למטה) אני לא יודע. תמונת MSME. פרמטרים בסיסיים היו כדלקמן: זמן חזרה 500 ms, זמן הד 5.2 ms, 28 ממוצעים, זמן רכישה 15 שעות 55 מ ‘. רזולוציה 13 x 13 x 13 μm3. גודל מטריצה היה 128 x 64 x 64 ושדה תצוגה 1.6 x 0.8 x 0.8 מ”מ. רוחב פס של מקלט 70 kHz. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 9: הדמיה תלת-ממדית של גוש שורש של מדיקאטולה מדיקאגו. תמונהברזולוציהנמוכה. פרמטרים בסיסיים היו כדלקמן: זמן חזרה 60 ms, זמן הד 2.3 ms, 4 ממוצעים, זמן רכישה 4 m. רזולוציה 31 x 31 x 31 μm3. גודל מטריצה היה 64 x 32 x 32 ושדה תצוגה 2 x 1 x 1 מ”מ. רוחב פס של מקלט 50 kHz. (למטה) אני לא יודע. תמונה ברזולוציה גבוהה. פרמטרים בסיסיים היו כדלקמן: זמן חזרה 60 ms, זמן הד 2.3 ms, 8 ממוצעים, זמן רכישה 33 מ ‘. רזולוציה 16 x 16 x 16 μm3. גודל מטריצה היה 128 x 64 x 64 ושדה תצוגה 2 x 1 x 1 מ”מ. רוחב פס של מקלט 50 kHz. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

פרוטוקול זה מתאים ביותר לדגימות ביולוגיות, כמו חומרים רבים ודגימות גיאולוגיות יש זמני הרפיה T2 קצרים באופן משמעותי, אשר לא ניתן למצוא תמונה על ידי הרצפים המשמשים כאן. אפילו כמה רקמות ביולוגיות, אשר להפגין הטרוגניות מגנטית דגימה גבוהה, יכול להיות קשה לדמיין בשדה אולטרה גבוה כמו ההשפעות מתואמות כוח השדה24. הפרוטוקול הוא לא רק שימושי עבור סלילים חדשים, אבל עשוי גם לסייע בפתרון בעיות פוטנציאליות. בעת בדיקת דגימות חדשות או לא ידועות, ניתן לבצע פרוטוקול זה מראש בפתרון ההפניה כדי לוודא שתוכנית ההתקנה הניסיונית פועלת בהתאם למפרטים. זה מסייע בפתרון בעיות מאז ספקטרומטר ניתן לפסול כמקור של חפצים ותקלות. בנוסף, כך מגדירים את קבלי כוונון והתוומת בבדיקה לערכים האופייניים למיקרו-סליל.

כאשר לא נרשם אות בניסוי הראשון, ניתן להגדיל את שדה התצוגה של סריקת המקום כדי לבדוק אם הדגימה נראית. לאחר מכן, בדוק שוב אם הבוליל מכוון כראוי ונסה סריקה נוספת של localizer. ייתכן שהבוליל מציג מצבי תהודה לא מכוונים נוספים, במקרה כזה יש לקבוע את הנכון. אם עדיין לא ניתן להשיג תמונה, הסר את הדגימה כדי לבדוק את מיקומה בתוך מכלול המיקרו-קוסקוס ולוודא שהדגימה שלמה (כלומר, לא קיימות בועות אוויר או דליפות באטום). לבסוף, ניתן להכין דגימה עם מים במקום PFD. במקרה שהדגימה נותנת מעט מאוד אותות ניתנים לזיהוי בסריקת המקיף, עדיין ניתן לזהות את המים שמסביב ים.

כמו מיקרו סלילים הם באופן אידיאלי קרוב מאוד לדגימה, ההבדלים רגישות מגנטית בין האוויר ואת החוט יכול לגרום לאובדן אותות נוספים, כפי שניתן לראות איור 7B. חפצים פוטנציאליים כוללים תאמות מרחביות ושונות עוצמת אות חריגה. במיוחד רצפי פולס מסוג מסוג מעבר צבע מושפעים מאובדן אותות לא אחיד זה. מסיבה זו, אנו הציגו את הבוליל התום לרגישות, על ידי שקוע החוט בנוזל פלואורינרט (Fomblin או FC-43). שיטת ההערכה B1 הכלולה בפרוטוקול זה יכולה לסייע לקבוע אם הבדלי הרגישות B1 מצדיקים הכללה של אסטרטגיות התאמת רגישות בעיצוב מכלול ההתפתלות. גישה חלופית לבניית 25 תיל תואם לרגישות היא להשתמש בחוט תואם רגישות25. יתר על כן, רק בעיות רגישות בשל תסיל מטופלים בגישה זו. חוסר התאמות רגישות בתוך המדגם (למשל, בשל מרחבים אוויריים) נשארים מאתגרים.

כיסי אוויר או בועות מהווים אתגר ניסיוני הגורמים לאובדן אותות נרחב, הנגרמת על ידי הבדלי רגישות בממשק האוויר והנוזלאו הדגימה 19 (איור 5A). היבט קריטי של הכנת מדגם מוצלח הוא הצוללת של דגימה ונימות. עם זאת, אפילו בועות קטנות יכולות לגרום להפסדי אותות, במיוחד עבור רצפי סוג הד הדרגתי. בועות אוויר ניידות יכולות לנדוד דרך נמת עד שהן נמצאות בקשר עם הדגימה. חלק מתופעות אלה ניתן להקל על ידי הטיה קלה של נמת כך קצה אחד הוא גבוה יותר מהשני. הטיה מבטיחה בועות אוויר פוטנציאליות מוחזקות במקום בקצה העליון, מבלי להפריע הדגימה. חשוב גם לבדוק כי שעוות נימות יוצרת חותם טוב, כמו התייבשות יכולה לגרום בועות אוויר גדולות ליצור.

עבור המרחבים האוויריים בתוך המדגם, PFD שימש למילוי מרחבי האוויר הבין-תאיים מבלי ליחודר את קרום התא26. עם זאת, גם בגישה זו, לא הצלחנו להסיר את כל מרחבי האוויר. בנוסף, גישה זו פירושה שאנו זקוקים לסוכן נוסף, שבדרך כלל אינו מועדף בשל הרצון ללמוד מערכת באופן לא פולשני ככל האפשר.

הצורה הגלילית של נימים פירושה כי תכונות זברה צריך להיות בר קיימא, במיוחד עבור רקמות פגיעים לריקבון, כגון ביופסיות או לימוד תהליכים בחומר שורש חי. שני שלבים יכולים לממש את כיוונון ההתניידות. ראשית, חיבור צינור הזנה בינוני, כמו גם צינור ניקוז משני צידי ניצור יהיה מספיק כדי ליצור כימותרפיה. שנית, תוספת של חזרם נימי הדגימה יכולה להחזיק את המדגם במקום כנגד כיוון הזרימה. הדבר מקביל לפרוטוקול שפורסם עבור מיקרו-קוסלים מיכניים10.

האופי הלא פולשני של הדמיית MR, בשילוב עם הנוזל אינרטי המשמש בפרוטוקול זה (PFD או Fomblin) פירושו לאחר השלמת ניסויים, דגימות ניתן להסיר מן הנימים שלהם למחקר נוסף. השילובים כוללים מיקרוסקופ אופטי או אלקטרונים וטכניקות הדמיה הרסניות אחרות. לאחרונה הראינו שילוב עם מיקרוסקופיה אופטית על Nodules שורש truncatula Medicago 27.

הראינו שיטה להדמיית חומר צמחי באמצעות מיקרו-סלילים ייעודיים על ספקטרומטר NMR שדה גבוה במיוחד. אמצעי אחסון לדוגמה גדולים יחסית ניתן ללמוד ברזולוציה גבוהה עם הומוגניות RF טובה. יתר על כן, הדמיה ספקטרוסקופית יכולה להתבצע ברזולוציות גבוהות יותר מאשר אפשרי אחרת. התאמת עיצוב מיקרו-קוסם לדגימות מתאפסת בשיטה יעילה לקביעת מאפייני ביצועי הבולבול. הגישה סולנואידים סיליל יכול להיות מיושם גם בקלות על דגימות אחרות מאשר צמחים, כולל רקמת בעלי חיים.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ניסויים במכשיר 950 MHz נתמכו על ידי uNMR-NL, מתקן לאומי במימון NWO בקנה מידה גדול של הולנד (פרויקט 184.032.207). R.S. נתמך על ידי פרויקט קונסורציום BioSolarCells U2.3. J.R.K. נתמך על ידי בית הספר לחקר תהודה מגנטית של הולנד (NMARRS) בית הספר לתואר שני [022.005.029]. אנו מודים לדפנג שן וטון ביסלינג על שסיפקו את דגימות ה-Medicago truncatula. אנו מודים גם Klaartje Houben, מארי רנו, ויוהאן ואן דר זוואן לתמיכה טכנית במתקן uNMR-NL. ברצוננו גם להודות לוולקר להמן, האני ג’נסן, ו פיטר דה וארד על העזרה הטכנית. אנו מביעים את תודתנו לפרנק ורג’ולט, ג’ון פיליפי, וקארת’יק ב. סאי סאנקר גופטה על עצתם. לבסוף, אנו מודים לג’סיקה דה רויטר על שסיפקה את קריינות הוידאו.

Materials

Reference solution preparation
CuSO4 Sigma-aldrich 469130 Crystalline powder for creating reference solution
D2O Sigma-aldrich 151882 Liquid used to prepare reference sample
Weigh Scale Sartorius PRACTUM513-1S Scale for weighing compounds
Sample preparation
Capillary 1000 μm (Outer diameter) Hilbenberg GmbH 1408410 Sample capillaries
Capillary wax Hampton Research HR4-328 Solid wax used to seal samples
Disposable Scalpel Swann-Morton No. 11 Used to excise samples
Perfluorodecalin Sigma-aldrich P9900 Liquid used for submerging sample
Stereo Microscope Olympus SZ40 Tabletop binocular microscope
Syringe Generic – Used to apply PFD and manipulate the sample
Vacuum Pump Vacuubrand MZ2C Two-stage membrane vacuumpump used for removing air pockets from samples.
Wax pen Hampton Research HR4-342 Handheld wax pen used to melt and apply capillary wax to samples
Imaging Hardware
22.3 T Magnet Bruker GmbH 950 US2 Narrowbore superconducting magnet
Air cooler Bruker GmbH – Used to regulate probe temperature
Console Bruker GmbH Avance III HD Controls operation of the spectrometer
Micro5 gradient coils Bruker GmbH Mic5 Removable gradient coils mount on the Micro5 probe body
Micro5 Probe body Bruker GmbH Mic5 Holds microcoils and gradient coils
RF microcoil Home-built – contains Fomblin
Vector Network Analyzer Copper Mountain Technologies TR1300/1 Used to perform S11 reflectance test, frequency range 300kHz to 1.3 GHz
Water cooler Bruker GmbH BCU-20 Open loop watercooling to dissipate heat from gradient coil operation.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ciobanu, L., Pennington, C. H. 3D micron-scale MRI of single biological cells. Solid State Nuclear Magnetic Resonance. 25 (1-3), 138-141 (2004).
  2. Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
  3. Radecki, G., Nargeot, R., Jelescu, I. O., Le Bihan, D., Ciobanu, L. Functional magnetic resonance microscopy at single-cell resolution in Aplysia californica. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8667-8672 (2014).
  4. Lee, C. H., et al. Magnetic Resonance Microscopy (MRM) of Single Mammalian Myofibers and Myonuclei. Scientific Reports. 7 (1), 39496 (2017).
  5. Callaghan, P. T. . Principles of nuclear magnetic resonance microscopy. , (1994).
  6. Glover, P., Mansfield, S. P. Limits to magnetic resonance microscopy. Reports on Progress in Physics. 65 (10), 1489-1511 (2002).
  7. Peck, T. L., Magin, R. L., Lauterbur, P. C. Design and analysis of microcoils for NMR microscopy. Journal of Magnetic Resonance. Series B. 108, 114-124 (1995).
  8. Lee, C. H., Flint, J. J., Hansen, B., Blackband, S. J. Investigation of the subcellular architecture of L7 neurons of Aplysia californica using magnetic resonance microscopy (MRM) at 7.8 microns. Scientific Reports. 5, 11147 (2015).
  9. Fratila, R. M., Velders, A. H. Small-Volume Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Annual Review of Analytical Chemistry. 4 (1), 227-249 (2011).
  10. Flint, J. J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition. Journal of Visualized Experiments. (128), 1-10 (2017).
  11. Minard, K. R., Wind, R. A. Solenoidal microcoil design. Part I: Optimizing RF homogeneity and coil dimensions. Concepts in Magnetic Resonance. 13 (2), 128-142 (2001).
  12. Vegh, V., Gläser, P., Maillet, D., Cowin, G. J., Reutens, D. C. High-field magnetic resonance imaging using solenoid radiofrequency coils. Magnetic Resonance Imaging. 30 (8), 1177-1185 (2012).
  13. Minard, K. R., Wind, R. A. Solenoidal microcoil design Part II: Optimizing winding parameters for maximum signal-to-noise performance. Concepts in Magnetic Resonance. 13 (3), 190-210 (2001).
  14. Haase, A., et al. NMR probeheads for in vivo applications. Concepts in Magnetic Resonance. 12, 361-388 (2000).
  15. Webb, A. G. Radiofrequency microcoils for magnetic resonance imaging and spectroscopy. Journal of Magnetic Resonance. 229, 55-66 (2013).
  16. Peck, T. L., Magin, R. L., Lauterbur, P. C. Design and Analysis of Microcoils for NMR Microscopy. Journal of Magnetic Resonance, Series B. 108 (2), 114-124 (1995).
  17. Olson, D. L., Peck, T. L., Webb, A. G., Magin, R. L., Sweedler, J. V High-Resolution Microcoil 1H-NMR for Mass-Limited, Nanoliter-Volume Samples. Science. 270 (5244), (1995).
  18. Oerther, T. . Micro Imaging Manual for AV3 Systems. , (2012).
  19. Callaghan, P. T. Susceptibility and Diffusion Effects in NMR Microscopy. Encyclopedia of Magnetic Resonance. , (2007).
  20. Donker, H. C. W., Van As, H., Snijder, H. J., Edzes, H. T. Quantitative 1H-NMR imaging of water in white button mushrooms (Agaricus bisporus). Magnetic Resonance Imaging. 15 (1), 113-121 (1997).
  21. Tsai, W. T. Environmental property modelling of perfluorodecalin and its implications for environmental fate and hazards. Aerosol and Air Quality Research. 11 (7), 903-907 (2011).
  22. Keifer, P. A. 90° pulse width calibrations: How to read a pulse width array. Concepts in Magnetic Resonance. 11 (3), 165-180 (1999).
  23. Vlaardingerbroek, M. T., den Boer, J. A. . Magnetic Resonance Imaging: Theory and Practice. , 05252-05255 (2003).
  24. Schenck, J. F. The role of magnetic susceptibility in magnetic resonance imaging: MRI magnetic compatibility of the first and second kinds. Medical Physics. 23 (6), 815-850 (1996).
  25. Kc, R., Henry, I. D., Park, G. H. J., Aghdasi, A., Raftery, D. New solenoidal microcoil NMR probe using zero-susceptibility wire. Concepts in Magnetic Resonance Part B: Magnetic Resonance Engineering. 37 (1), 13-19 (2010).
  26. Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).
  27. van Schadewijk, R., et al. Magnetic Resonance Microscopy at Cellular Resolution and Localised Spectroscopy of Medicago truncatula at 22.3 Tesla. Scientific Reports. 10 (1), 971 (2020).

Tags

MRIMicrocoilsUltra High FieldPerformance CalibrationMedicago TruncatulaRootsNMR SpectrometerSolenoid MicrocoilTuning CapacitorMatching CapacitorSusceptibility Matching FluidPerfluorodecalinCopper Sulfate SolutionPlant RootCellular ResolutionSignal-to-noise Ratio

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
van Schadewijk, R., Krug, J. R., Webb, A., Van As, H., Velders, A. H., de Groot, H. J. M., Alia, A. MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T. J. Vis. Exp. (167), e61266, doi:10.3791/61266 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image