On-Site bemonstering en extractie van hersentumoren voor metabolomics en lipidomics analyse
Summary
Het manuscript presenteert on-site bemonstering van menselijke hersentumoren met vaste fase microextractie, gevolgd door hun biochemische profilering naar de ontdekking van biomarkers.
Abstract
Ondanks de verscheidenheid van tools beschikbaar voor kanker diagnose en classificatie, methoden die het mogelijk maken snelle en eenvoudige karakterisering van tumoren zijn nog steeds in nood. In de afgelopen jaren is massaspectrometrie een methode geworden voor ongerichte profilering van discriminerende verbinding als potentiële biomarkers van een ziekte. Biofluïden worden over het algemeen beschouwd als voorkeur matrices gezien hun toegankelijkheid en gemakkelijkere monsterverwerking, terwijl directe weefselprofilering meer selectieve informatie over een bepaalde kanker biedt. De bereiding van weefsels voor de analyse via traditionele methoden is veel complexer en tijdrovender en daarom niet geschikt voor snelle analyse ter plaatse. Het huidige werk presenteert een protocol dat monstervoorbereiding en extractie van kleine moleculen ter plaatse combineert, onmiddellijk na tumorresectie. Het bemonsteringsapparaat, dat zo groot is als een acupunctuurnaald, kan direct in het weefsel worden ingebracht en vervolgens naar het nabijgelegen laboratorium worden vervoerd voor instrumentele analyse. De resultaten van metabolomics en lipidomics analyses tonen het vermogen van de aanpak voor de oprichting van fenotypes van tumoren in verband met de histologische oorsprong van de tumor, maligniteit, en genetische mutaties, evenals voor de selectie van discriminerende verbindingen of potentiële biomarkers. De niet-destructieve aard van de techniek maakt latere uitvoering van routinematig gebruikte tests mogelijk, bijvoorbeeld histologische tests, op dezelfde monsters die worden gebruikt voor SPME-analyse, waardoor uitgebreidere informatie kan worden verkregen ter ondersteuning van gepersonaliseerde diagnostiek.
Introduction
Magnetic Resonance Imaging (MRI) en Computertomografie (CT) zijn de belangrijkste methoden die worden gebruikt voor de real-time analyse van hersenletsels. Hersentumor differentiatie is over het algemeen gebaseerd op histopathologie met extra vlekken en geavanceerde immunohistochemische technieken. Volgens de bijgewerkte richtlijnen voor centrale nerveuze hersentumoren uitgegeven door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) in 2016, genetische tests zijn cruciaal voor de differentiatie en classificatie van deze tumoren1. Differentiatie en classificatie van tumoren stellen artsen in staat om de meest effectieve behandeling voor een bepaald type tumor te kiezen, waardoor de levensverwachting van de patiënt wordt uitgebreid. Helaas, ondanks de beschikbaarheid van dergelijke geavanceerde methoden om artsen te helpen bij het selecteren van een optimale therapie voor hun patiënten, de levensverwachting van patiënten gediagnosticeerd met glioblastoom (IV rang glioom) is slechts ongeveer 15-16 maanden2. Zelfs met de verfijning en verhoogde nauwkeurigheid van de genoemde beeldvorming en histologische methoden als diagnostische instrumenten, is er nog steeds een grote behoefte aan nieuwe technieken die in staat zijn om aanvullende informatie aan te bieden om artsen te helpen bij beslissingen over het verloop van de behandeling. In de afgelopen jaren zijn verschillende nieuwe benaderingen op basis van massaspectrometrie voorgesteld voor intraoperatieve analyse van kanker3,4. Het potentieel van vaste fase microextractie (SPME), de methode die hierin wordt gepresenteerd, als een snel on-site analyseinstrument, is reeds aangetoond in verschillende studies5. Het huidige manuscript toont een van de klinische toepassingen van de methode, ongerichte metabolomics en lipidomics van menselijke hersentumoren. Ongerichte onderzoeken vormen een belangrijk uitgangspunt bij de ontdekking van potentiële biomarkers. Eenmaal vastgesteld, kunnen dergelijke biomarkers vervolgens worden gebruikt als diagnostische verwijzingen om onderscheid te maken tussen tumoren met behulp van dezelfde technologie gekoppeld aan on-site instrumentatie.
SPME is een op evenwicht gebaseerde monsterpreparaattechniek die kleine moleculen uit monstermatrices haalt met behulp van kleine hoeveelheden extractiefase. In spme’s meest traditionele configuratie van het apparaat (sonde), wordt een vezel bedekt met een geschikte extractiefase en geïmmobiliseerd op een solide ondersteuning d.w.z. een metalen draad5,6. Biocompatibele coatings en apparaten (sondes) maken extractie rechtstreeks uit complexe biologische matrices mogelijk zonder monstervoorbehandeling, bijvoorbeeld homogenisatie en filtratie. Door het extractieproces worden analyten verdeeld tussen de extractiefase en de monstermatrix in verhouding tot hun initiële concentraties. Als de extractie lang genoeg wordt uitgevoerd, wordt evenwicht bereikt. Hoewel extractie bij evenwicht de hoogst mogelijke gevoeligheid en reproduceerbaarheid biedt, is pre-evenwichtsextractie ook mogelijk en in sommige gevallen zelfs de voorkeur, d.w.z. in vivo bemonstering, waarbij tijdsbeperkingen in verband met de bemonstering ter plaatse (bijvoorbeeld operatie- of noodruimten) snelle extracties vereisen. Het extractietijdprofiel van een bepaalde analyt wordt over het algemeen beïnvloed door de fysisch-chemische eigenschappen van de analyt, de bemonsterde matrix, het gebruikte type sorbent en verschillende andere extractieomstandigheden. De overvloed aan factoren die hun extractiekinetiek bepalen, maakt het praktisch onmogelijk om evenwichtsextractie van alle verbindingen te garanderen wanneer ongerichte analyses zoals metabolomics of lipidomics worden uitgevoerd. Om bovengenoemde redenen werd de extractietijd van het huidige protocol willekeurig vastgesteld om een bevredigende gevoeligheid en dekking van metabolieten enerzijds en bruikbaarheid voor gebruik ter plaatse anderzijds te waarborgen.
Er zij op gewezen dat de zeer kleine omvang van de sondes die worden gebruikt voor de extractie van monsters uit weefsels slechts minimale weefselschade veroorzaakt, terwijl de bemonsteringsprocedure zelf geen weefsel verbruikt, maar zeer kleine hoeveelheden kleine moleculen uit het bemonsterde gebied; Daarom kan hetzelfde monster verder worden gebruikt voor routinetests, d.w.z. histologisch of genetisch, zodat essentiële en aanvullende informatie uit hetzelfde monster kan worden vervulling gegaan. Dergelijke aanvullende, uitgebreide gegevens zouden een beter begrip van tumorbiologie mogelijk maken, hopelijk de ontdekking van nieuwe behandelingsdoelen vergemakkelijken. Het gebruik van deze methode verhoogt de mogelijkheid van intraoperatieve diagnostiek ter plaatse bij het bepalen van doelbiomarkers.
Hieronder presenteren we protocollen voor de bemonstering van hersentumoren ter plaatse voor metabolomics en lipidomics analyses en gegevensverwerking.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ongerichte metabolomics en lipidomics worden vaak gebruikt in studies gericht op het identificeren van tumorbiomarkers. Echter, in de meeste gevallen, onderzoekers op zoek naar verbindingen die kunnen worden gebruikt voor screening van de ziekte. Bijgevolg, de voorkeur biologische monsters zijn bloed of urine als gevolg van hun relatief gemakkelijke toegang. Analyse van tumorweefsel wordt voornamelijk uitgevoerd om de mechanismen achter de ziekte te begrijpen, verschillende tumortypen te karakteriseren, enz. On-site analyse van tumor biomarkers wordt zelden uitgevoerd, omdat dergelijke toepassingen uitgebreide monstervoorbereiding vereisen. Als alternatief verdienen strategieën op basis van real-time analyse van weefselprofielen zonder voorselectie van specifieke biomarkers de aandacht van de medische gemeenschap3,4. De hierin gepresenteerde oplossing biedt een ander perspectief op weefselverwerking ter plaatse door het type informatie te onthullen dat via dergelijke methoden kan worden verkregen.
De combinatie van bemonstering, monsterbereiding en extractie maakt SPME een zeer nuttig hulpmiddel voor analyse ter plaatse. Bovendien maakt het gebrek aan weefselverbruik tijdens de bemonstering het verdere gebruik van dezelfde monsters voor biomarkeranalyse en routinetests (genotypering, histologische analyse) mogelijk, waardoor nieuwe informatie wordt toegevoegd aan de resultaten van standaardtests. Het bemonsteringsapparaat heeft een zeer eenvoudig ontwerp, de werking ervan is zeer eenvoudig en er is geen speciale training nodig om de extractie zelf uit te voeren. Het bereiken van betrouwbare resultaten vereist echter veel meer dan alleen een goede behandeling van apparaten. Om het experiment goed uit te voeren, moet men het extractieproces, de aard van het monster begrijpen en zich bewust zijn van mogelijke fouten die de gegevens kunnen beïnvloeden.
Het is belangrijk om rekening te houden met de heterogeniteit van kankerweefsel10; bemonsterde tumoren kunnen delen bevatten die necrose, verkalking en hypoxie ondergaan, en elk van deze processen zal worden weerspiegeld in de metabolome en lipidome bereikt, waardoor de resultaten worden beïnvloed. Daarom wordt aanbevolen om bemonstering met ruimtelijke resolutie uit te voeren door het inbrengen van verschillende vezels in verschillende delen van het kankerweefsel, of als alternatief, dat een langere coating wordt gebruikt om het geheel van de tumor binnen te dringen om gemiddelde informatie over de tumor te verkrijgen. Als de bemonsteringsmethode voor ruimtelijke resolutie wordt uitgevoerd, kunnen vezels allemaal in één desorptieoplosmiddel worden gedesorbeerd; dit zou niet alleen het verkrijgen van algemene informatie over de tumor mogelijk maken, maar ook de gevoeligheid van de analyse verhogen. Als alternatief zou desorptie van individuele vezels in afzonderlijke flesjes onderzoeken mogelijk maken om de interne diversiteit van de hersentumor te achterhalen, die bestaat uit de kern die is opgebouwd uit kankercellen, en de buitenste zone, die de grens van gezond weefsel is. Diepere delen van de tumor zijn meestal meer beschadigd door de processen in verband met kanker11. Onderzoekers moeten echter in gedachten houden dat deze optie de gevoeligheid van de methode en het totale aantal detecteerbare verbindingen compromitteert. In het huidige werk werd een 7 mm coating gebruikt; deze lengte werd beschouwd als optimaal voor verschillende maten tumoren opgenomen in de studie. De coatings doordrongen de tumoren, en dus niet-speciale resolutie, maar gemiddeld gegevens over het monster. Ongeacht het gekozen protocol is het belangrijk dat hetzelfde protocol tijdens de hele studie wordt gevolgd, inclusief het aantal vezels dat wordt gebruikt voor individuele bemonstering, de lengte van de coating, extractietijd en alle andere factoren die in dit werk zijn afgebakend.
Het is belangrijk om de kwaliteit van de analyse te controleren. De gepoolde QC (zie de stappen 4.7 en 7.7 in het protocol) moet worden voorbereid en gebruikt voor het bewaken van de stabiliteit van het instrument tijdens de werking van de gehele monsterpartij. De blanco besturingselementen (zie stap 2.8) kunnen later worden gebruikt om een “uitsluitingslijst” op te stellen om signalen van verontreinigingen afkomstig van oplosmiddelen of vezelproductie te elimineren. Bij speciale gelegenheden, zoals een besmettingsrisico, is het noodzakelijk om monsters te nemen van handschoenen, tafels, apparaten of andere oppervlakken die een besmettingsrisico kunnen opleveren. In dergelijke gevallen zijn vezelpreparaat, extractietijd en desorptieprotocollen hetzelfde als voor de monsters.
Metabolomic en lipidomic analyses zijn volledig gericht op kleine moleculen (minder dan 1.500 Da) die in een organisme of specifieke componenten van het organisme, zoals specifieke organen, weefsel, vloeistoffen, cellen, enz. Metabolomic en lipidomics bieden een momentopname van biochemische veranderingen die zich in het lichaam voordoen, en in het geval van kanker, integreren ze informatie met betrekking tot het genoom, histologie en maligniteit van de tumor. Deze omics wetenschappen creëren een verband tussen fysiologie en fenotype als metabolieten hoger in de biochemische ladder staan dan eiwitten of genen12. Door het begrijpen van de metabokoom en lipidome van kankertumoren, komen we dichter bij het ontdekken van het fenotype onder alle -omics wetenschappen als deze takken van de studie bieden meer diepgaande kennis van dynamische veranderingen van moleculen als een reactie van levende organismen op verschillende stimuli. Zoals in dit werk wordt voorgesteld, komen de gegevens die in één bemonstering zijn verkregen overeen met de histologie van de kanker, de mate van maligniteit ervan, en weerspiegelen veranderingen die zich op genoomniveau voordoen. In gliooms, als het type kanker van belang in deze studie, de informatie verborgen in het genoom is bijzonder belangrijk, als een gepersonaliseerde behandeling wordt ontwikkeld op basis van de resultaten van genetische tests. Bijzondere mutaties zijn prognostische markers van de uitkomsten van de chemo- of radiotherapie. Zoals hier is aangetoond, is de selectie van biomarkers die een bepaalde mutatie weerspiegelen mogelijk met de voorgestelde strategie. Mutatie markers, evenals extra descriptoren types zoals die aangeven de mate van maligniteit van de tumor kan ook worden gebruikt ter ondersteuning van routine diagnostische methoden.
Ex vivo chemische biopsie met het gebruik van vaste fase microextractievezels is de eerste stap in de toepassing van de methode op intraoperatieve diagnostiek. De methode kan gemakkelijk worden aangenomen voor in vivo bemonstering in afwachting van toestemming van de juiste Ethische Boards. In dergelijke gevallen moet sterilisatie van SPME-apparaten worden uitgevoerd volgens de aanvaarde sterilisatieprocedures van het ziekenhuis waar bemonstering moet worden uitgevoerd, d.w.z. autoclaving of ethyleenoxidesterilisatie. De voorgeconditioneerde en gesteriliseerde vezels moeten worden bewaard in verzegelde verpakkingen met een sterilisatie vervaldatum. Het is belangrijk op te merken dat vezels niet moeten worden gereinigd met het gebruik van oppervlakteactieve stoffen. Een dergelijke procedure kan leiden tot niet-specifieke veranderingen in de sorbent samenstelling, waardoor de extractie van analyten. In de hierin beschreven studies werd een extractieperiode van 30 minuten gebruikt, maar andere rapporten valideren dat kortere tijden bevredigende resultaten kunnen opleveren in in vivo studies13. Huq et al. toonden aan dat analyt evenwichtstijd sneller wordt bereikt in weefsel, als een complexe matrix, dan in eenvoudige matrices14. De reproduceerbaarheid van de verkregen resultaten kan echter in het gedrang komen onder kortere extractieperioden, aangezien meer analyten onder pre-evenwichtsomstandigheden zullen worden gewonnen; Daarom moet nauwkeurige tijdscontrole worden uitgevoerd.
Beide omics wetenschappen uitgebuit als onderdeel van dit werk hebben een uitstekend potentieel als biomarker discovery tools. Zodra biomarkers zijn geselecteerd of een chemometrisch model is vastgesteld, kunnen medische diagnostiek op basis van de bepaling van doelmetabolieten via methoden die van toepassing zijn op on-site onderzoeken, zoals de SPME-benadering die in dit werk wordt beschreven, worden ontwikkeld en geïmplementeerd als onderdeel van routinediagnostiek.
Het protocol dat in dit manuscript wordt voorgesteld beschrijft hoe ongerichte metabolomic en lipidomic analyses van kankerweefsel uit te voeren met behulp van vaste fasemicroextractie voor screening van potentiële biomarkers. Het is ontworpen om extractie van representatieve verbindingen mogelijk te maken, differentiatie van tumoren en identificatie van discriminerende verbindingen die een bepaalde vorm van kanker kenmerken, d.w.z. potentiële biomarkers. De ongerichte analyses met SPME beschreven in dit artikel vormen een uitgangspunt in de ontwikkeling van snelle intraoperatieve diagnostiek, waarbij een geselecteerd paneel van verbindingen kan worden bepaald zonder de noodzaak voor screening van alle verbindingen die in het monster aanwezig zijn. In het belang van snelle diagnostische resultaten kunnen SPME-sondes die worden gebruikt voor on-site extractie direct worden gekoppeld aan analytische instrumenten in de ziekenhuisfaciliteit. Eenvoudige extracties uitgevoerd met minimale monstervoorbereiding gevolgd door chromatografievrije analyse zouden de totale tijd aanzienlijk verkorten van uren tot enkele minuten, zoals reeds is beschreven voor het toezicht op geneesmiddelen15.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studie werd ondersteund door subsidie Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 van het National Science Centre. De auteurs willen MilliporeSigma, een bedrijf van Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland, erkennen voor het leveren van de SPME-apparaten die in dit werk worden gebruikt. De life science business van Merck opereert als MilliporeSigma in de VS en Canada. Ook willen de auteurs Thermo Fisher Scientific bedanken voor de toegang tot de Q-Exactive Focus orbitrap massaspectrometer.
Bijdragen van auteurs: JB: optimalisatie van de parameters voor monstervoorbereiding en LC-MS, prestaties van SPME-LC-MS experimenten, gegevensanalyse, statistische analyse en gegevensinterpretatie en manuscriptvoorbereiding met betrekking tot lipidomics deel; PZG: coördinatie en prestaties van de meeste bemonsteringen in het ziekenhuis, optimalisatie van bemonsterings- en monstervoorbereidingsparameters, prestaties van SPME-LC-MS-experimenten, gegevensanalyse, statistische analyse en gegevensinterpretatie, manuscriptvoorbereiding met betrekking tot metabolomics- deel; MG – hulp bij de optimalisatie van de voorbereiding van monsters, LC-MS methode en data-analyse met betrekking tot lipidomics deel; KG: co-performance van SPME-bemonsteringen en optimalisatie van bemonstering en monstervoorbereiding, SPME-LC-MS-analyse met betrekking tot metabolomics-onderdeel; KC: prestaties van verschillende SPME-bemonsteringen in het ziekenhuis, hulp bij het optimaliseren van bemonstering, monstervoorbereiding en gegevensanalyse met betrekking tot metabolomics-onderdeel; KJ: prestaties van verschillende SPME-bemonsteringen in het ziekenhuis, hulp bij lipidomics-analyse; DP: prestaties van chirurgische ingrepen, werving van de patiënten; JF: prestaties van chirurgische ingrepen, werving van de patiënten; MH: uitvoering van chirurgische ingrepen, coördinatie van het klinische deel van het onderzoek; BB: concept, coördinatie toezicht op het project en manuscriptvoorbereiding, uitvoering van verschillende bemonsteringen
Materials
| acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
| ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
| caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
| formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
| glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
| glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
| glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
| isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
| methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
| Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
| SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
| SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
| SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
| water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9×5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Bi, W. L., Beroukhim, R. Beating the odds: extreme long-term survival with glioblastoma. Neuro Oncology. 16 (9), 1159-1160 (2014).
- Ifa, D. R., Eberlin, L. S. Ambient Ionization Mass Spectrometry for Cancer Diagnosis and Surgical Margin Evaluation. Clinical Chemistry. 62, 111-123 (2016).
- Alexander, J., et al. A novel methodology for in vivo endoscopic phenotyping of colorectal cancer based on real-time analysis of the mucosal lipidome: a prospective observational study of the iKnife. Surgical Endoscopy. 31 (3), 1361-1370 (2017).
- Reyes-Garcés, N., et al. Advances in Solid Phase Microextraction and Perspective on Future Directions. Analytical Chemistry. 90, 302-360 (2018).
- Pawliszyn, J. . Handbook of Solid Phase Microextraction. , (2009).
- Vuckovic, D., Pawliszyn, J. Systematic Evaluation of Solid-Phase Microextraction Coatings for Untargeted Metabolomic Profiling of Biological Fluids by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 83, 1944-1954 (2011).
- Cajka, T., Fiehn, O. Comprehensive analysis of lipids in biological systems by liquid chromatography-mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 61, 192-206 (2014).
- Goryńska, P. Z., et al. A new strategy for brain tumour metabolomic analysis. Medical Research Journal. 3 (1), 15-22 (2018).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Fernandes, M., Rosel, D., Brábek, J. Translation in solid cancer: are size-based response criteria an anachronism. Clinical Translational Oncology. 17 (1), 1-10 (2015).
- Lämmerhofer, M., Weckwerth, W. . Metabolomics in Practice: Successful Strategies to Generate and Analyze Metabolic Data. , (2013).
- Lendor, S., et al. Solid Phase Microextraction- Based Miniaturized Probe and Protocol for Extraction of Neurotransmitters from Brains in Vivo. Analytical Chemistry. 91 (7), 4896-4905 (2019).
- Huq, M., Tascon, M., Nazdrajic, E., Roszkowska, A., Pawliszyn, J. Measurement of Free Drug Concentration from Biological Tissue by Solid-Phase Microextraction: In Silico and Experimental Study. Analytical Chemistry. 91 (12), 7719-7728 (2019).
- Looby, N., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
