Syftet med denna teknik är ex vivo visualisering av pulmonell arteriell nätverk av tidiga postnatala och vuxna möss genom lunginflation och injektion av en radio-ogenomskinlig polymer-baserad förening via pulmonell gatan. Potentiella tillämpningar för gjutna vävnader diskuteras också.
Blodkärl bildar intrikata nätverk i 3-dimensionell rymd. Följaktligen är det svårt att visuellt uppskatta hur vaskulära nätverk interagerar och beter sig genom att observera ytan av en vävnad. Denna metod ger ett medel för att visualisera den komplexa 3-dimensionella vaskulära arkitekturen i lungan.
För att åstadkomma detta sätts en kateter in i lungartären och vasculaturen spolas samtidigt av blod och kemiskt vidgade för att begränsa resistensen. Lungor sedan blåses upp genom luftstrupen vid ett standardtryck och polymerföreningen infunderas i kärlbädden vid en standardflöde. När hela artärnätet är fyllt och tillåtet att bota, kan lungvasculature visualiseras direkt eller avbildas på en mikro-CT (μCT) scanner.
När den utförs framgångsrikt, kan man uppskatta pulmonell arteriellt nätverk i möss som sträcker sig från tidiga postnatala åldrar till vuxna. Dessutom, medan visat i pulmonal arteriell säng, denna metod kan tillämpas på alla vaskulär säng med optimerad kateter placering och endpoints.
Fokus för denna teknik är visualiseringen av pulmonell arteriell arkitektur med hjälp av en polymerbaserad förening hos möss. Medan omfattande arbete har utförts på systemiska vaskulära sängar såsom hjärna, hjärta, ochnjure 1,2,3,4,5, mindre information finns när det gäller framställning och fyllning av pulmonal arteriellt nätverk. Syftet med denna studie är därför att expandera på tidigare arbete6,7,8 och ge en detaljerad skriftlig och visuell referens som utredarna lätt kan följa för att producera högupplösta bilder av pulmonell arteriell träd.
Medan många metoder finns för märkning och bildframställning lungvaskulatur, såsom magnetisk resonanstomografi, ekokardiografi, eller CT-angiografi9,10, många av dessa modaliteter misslyckas med att tillräckligt fylla och / eller fånga de små fartyg, begränsa omfattningen av vad som kan studeras. Metoder som seriell snittning och rekonstruktion ger hög upplösning men är tid/arbetsintensiva11,12,13. Omgivande mjukvävnad integritet äventyras i traditionell korrosiongjutning 10,13,14,15,16. Även djur ålder och storlek blir faktorer vid försök att införa en kateter eller, upplösningen saknas. Polymerinjektionstekniken fyller å andra sidan artärerna till kapillärnivån och när den kombineras med μCT möjliggör oöverträffad upplösning5. Prover från muslungor så unga som postnatal dag 14 har framgångsrikt kastat8 och bearbetats på några timmar. Dessa kan omskannas på obestämd tid, eller till och med skickas för histologisk preparation/elektronmikroskopi (EM) utan att den befintliga mjukvävnaden17 – komprometterar. De viktigaste begränsningarna för denna metod är initialkostnaden för CT-utrustning/programvara, utmaningar med exakt övervakning av intravaskulärt tryck, och oförmågan att förvärva data i längsled hos samma djur.
Detta papper bygger på befintliga arbetet för att ytterligare optimera pulmonal artär injektion teknik och push ålder / storlek relaterade gränser ner till postnatala dag 1 (P1) att ge slående resultat. Det är mest användbart för lag som vill studera arteriella vaskulära nätverk. I enlighet med detta ger vi ny vägledning för kateterplacering/stabilisering, ökad kontroll över fyllnadsgrad/volym och lyfter fram anmärkningsvärda fallgropar för ökad gjutningsframgång. Resulterande kastar kan sedan användas för framtida karakterisering och morphologic analys. Kanske ännu viktigare, detta är den första visuella demonstrationen, till vår kunskap, som går användaren genom denna intrikata förfarande.
Utförda på rätt sätt, ger denna metod slående bilder av pulmonell arteriell nätverk, vilket möjliggör jämförelse och experiment i gnagare modeller. Flera kritiska steg på vägen säkerställer framgång. Först måste utredarna heparinisera djuret i det förberedande stadiet för att förhindra att blodproppar bildas i lungvaskulaturen och kamrarna i hjärtat. Detta möjliggör fullständig arteriell transitering av polymer förening. För det andra, när punktering membranet och ta bort bröstkorgen, var noga…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes delvis av NHLBI Intramural Research Program (DIR HL-006247). Vi vill tacka NIH Mouse Imaging Facility för vägledning inom bildförvärv och analys.
1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
Formalin | Sigma – Life Sciences | HT501128 | |
Gauze | Covidien | 441215 | |
Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
induction chamber | n/a | n/a | |
Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
Micro-CT system | SkyScan | 1172 | |
Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B – MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |