Heterolog Hücre Sisteminde Protein Toplama Yoluyla Hücrelerarası Etkileşimlerin Ölçülmesi
Summary
Burada, floresan mikroskopisi kullanarak heterolog bir hücre sisteminde transta ligand-reseptör etkileşimlerini hızlı ve yarı niteliksel olarak ölçmek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Hücresel arayüzlerdeki protein etkileşimleri, doku gelişimi ve kanserin ilerlemesinden sinaps oluşumu ve bakımına kadar çok sayıda biyolojik sonucu belirler. Bu temel etkileşimlerin çoğu transta gerçekleşir ve tipik olarak membran bağlantılı bağlama çiftlerini ifade eden hücreler arasındaki heterofilik veya homofilik etkileşimler tarafından indüklenir. Hastalıkla ilgili mutasyonların bu temel protein etkileşimlerini nasıl bozduğunun aydınlatıcı olması, sayısız hücre biyolojisi alanı hakkında fikir verebilir. Birçok protein-protein etkileşim tahlilleri tipik olarak cis ve trans etkileşimleri arasında ayrım yapmaz, bu da potansiyel olarak in vivo olarak meydana gelen ve protein ve / veya özel izleme ekipmanının emek yoğun saflaştırılmasını içeren bağlama kapsamının aşırı tahmin edilmesine yol açar. Burada, uzun protein saflaştırmalarına veya özel ekipmanlara ihtiyaç duymadan sadece trans etkileşimlerin gözlemlenmesine ve ölçülmesine izin veren optimize edilmiş basit bir protokol sunuyoruz. HEK hücre toplama tahlili, her biri membran bağlı konyak ligandlarını ifade eden iki bağımsız HEK hücresi popülasyonunun karıştırılmasıdır. Kısa bir kuluçka süresinden sonra, örnekler görüntülenir ve elde edilen agregalar ölçülür.
Introduction
Sinaptik yapışma molekülleri tarafından kolaylaştırılan sinaptik etkileşimler, sinapsların gelişimi, organizasyonu, spesifikasyonu, bakımı ve işlevi ve sinir ağlarının üretimi için temeldir. Bu transsynaptik hücre yapışma moleküllerinin tanımlanması hızla artmaktadır; bu nedenle, bağlayıcı ortakları tanımlamak ve bu yeni yapışma moleküllerinin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini anlamak temel olarak önemlidir. Ek olarak, genom dizilimi, yaygın olarak çok sayıda nörogelişimsel, nöropsikiyatrik ve bağımlılık bozukluğu ile bağlantılı olan bu yapışma moleküllerinin çoğunda mutasyonlar tanımlamıştır1. Sinaptik hücre yapışma moleküllerini kodlayan genlerdeki mutasyonlar trans etkileşimlerini zararlı bir şekilde değiştirebilir ve sinaps oluşumunda ve bakımında patofizyolojik değişikliklere katkıda bulunabilir.
İzotermal kalorimetre, dairesel dikroizm, yüzey plazmon rezonansı2 gibi protein-protein etkileşimlerini nicel olarak değerlendirmek için birden fazla tahlil mevcuttur ve doğada nicel olmasına rağmen, birkaç sınırlamaları vardır. İlk olarak, bazen uzun ve sıkıcı saflaştırma adımları gerektiren rekombinant protein gerektirirler. İkincisi, sofistike özel ekipman ve teknik uzmanlık gerektirirler. Üçüncüsü, doğal olarak bir membran in vivo’ya bağlı proteinler arasında hem cis hem de trans etkileşimlerine izin verdikleri için bağlamanın kapsamını abartabilirler. Burada sadece trans etkileşimlerini test eden basit ve nispeten hızlı bir test öneriyoruz.
Saflaştırılmış protein testleriyle ilişkili komplikasyonların çoğunu atlatmak için, azaltılmış heterolog hücre sisteminde trans etkileşimlerini yeniden sağlayan hücre bazlı bir protein etkileşimi testini optimize ettik. Bu test daha önce hücrelerarası etkileşimleri incelemek için çeşitli şekillerde kullanılmıştır. Bu yaklaşımda aday hücre yapışma molekülleri HEK293T hücrelerine aktarılır. Fizyolojik koşullarda, HEK293T hücreleri kendi kendine toplama sergilemez, bu da onları bu test için örnek modeller haline getirir. Bununla birlikte, reseptör ve ligand ifade eden HEK hücrelerinin bireysel popülasyonları birleştirildiğinde, reseptörün bağlanması ve ligand HEK hücrelerinin toplanmasına zorlar. Bu toplama sadece trans etkileşimleri tarafından aracılık edilir ve genellikle onlarca dakika içinde gözlemlenebilir. Bu yöntemde protein saflaştırma adımlarına gerek yoktur ve yöntemin verimliliği, kognate yapışma moleküllerini ifade eden HEK hücrelerinin popülasyonlarının birleştirildiği ve sadece on dakika sonra görüntülandığı paradigmasına dayanır. Ek olarak, bu yöntem nispeten ucuzdur, çünkü ne antikorlar ne de pahalı ekipmanlar gereklidir. Verilerin eldei için gerekli olan tek ekipman standart bir floresan mikroskoptur. Bu hücre bazlı testin ek bir avantajı, hastalıkla ilgili nokta mutasyonlarının trans etkileşimleri üzerindeki etkisini hızlı bir şekilde tarama yeteneğidir. Bu, ilgi çekici proteinin mutant varyantlarının cDNA’ları ile HEK hücrelerinin transfecting ile gerçekleştirilerek gerçekleştirilebilir.
Bu protokolde, derin zihinsel engellilik ve epilepsi tanısı alan bir hastada tanımlanan Neurexin3α’daki (Neurexin3αA687T)bir yanlış beyin mutasyonu,lösin bakımından zengin tekrarlayan transmembran protein 2 (LRRTM2) ile trans etkileşimlerini değiştirip değiştirmediğini araştırdığımız bir örnek sunuyoruz. Neurexin3α, evrimsel olarak korunmuş presinaptik hücre yapışma molekülleri ailesinin bir üyesidir ve son çalışmalar sinaps3, 4,5,6,7’debirden fazla rol belirlemiş olsa da, bu molekül ve neüroksin ailesinin tüm üyelerine ilişkin sinaptik anlayışımız eksik kalır. LRRTM2, sinaps oluşumu ve bakımı 8,9,10‘akatılan uyarıcı bir postynaptik hücre yapıştırma proteinidir. Daha da önemlisi, LRRTM2 sadece splice bölgesi 4 alternatif eksondan (SS4-) yoksun neurexin izoformları ile etkileşime girer, ancak splice bölgesi 4 alternatif ekson (SS4 +) içeren neurexin izoformları ile etkileşime girmez. Neurexin3α’da tanımlanan insan missense mutasyonu (A687T), evrimsel olarak korunan ve tüm alfa neurexins7arasında korunan, unstudied hücre dışı bir bölgede bulunur. Bu iki molekül arasındaki etkileşimkurulduğundan 8,9,11, şu soruyu ortaya attık: Neurexin3α SS4- to LRRTM2’nin bağlanma kabiliyeti bir A687T nokta mutasyonu ile mi değiştirildi? Bu tahlil, A687T nokta mutasyonunun beklenmedik bir şekilde Neurexin3α’nın toplanmasını LRRTM2’ye artırdığını ve nokta mutasyonunun bulunduğu hücre dışı bölgenin transsinaptik etkileşimlere aracılık etmede rol oynadığını ortaya koydu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücre yapışması sırasında transta meydana gelen protein-protein etkileşimlerinin parçalanması, olgunlaşma ve yeniden şekillendirme sırasında sinapsların oluşumu, işlevi ve bakımı da dahil olmak üzere temel hücresel süreçlerin altında bulunan moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına neden olabilir. Hücreden hücreye etkileşimlerin etkileri nörobiyolojinin ötesine genişler ve sinyal transdüksiyonunda, hücre göçünde ve doku gelişiminde daha geniş rollere sahiptir<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü’nden (R00MH103531 ve R01MH116901’den J.A.’ya), Ulusal Genel Tıp Enstitüsü’nden (T32GM007635’ten S.R.’ye) doktora öncesi eğitim Hibesi ve Lyda Hill Gilliam İleri Çalışma Bursu (GT11021’den S.R.’a) tarafından desteklendi. Mikroskopla ilgili yardımları için Dr. Kevin Woolfrey’e, epifluoresan mikroskopunun kullanımı için Dr. K Ulrich Bayer’e ve LRRTM2 plazmidi için Thomas Südhof’a (Stanford Üniversitesi) teşekkür ederiz.
Materials
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
References
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Lakey, J. H., Raggett, E. M. Measuring protein-protein interactions. Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).
- Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
- Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
- Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
- Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
- Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
- Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
- Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
- Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
- Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).
- Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
- Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).
