糸球体腎炎における細胞外DNAの半定量化のための教師付き機械学習
Summary
細胞死の間に放出される細胞外DNA(ecDNA)は炎症を誘発し、炎症に寄与する。傷害部位におけるecDNAの測定は、標的器官における治療の有効性を決定することができる。このプロトコルは、機械学習ツールを使用して腎臓組織のecDNAの測定を自動化する方法を説明します。
Abstract
糸球体細胞死は、骨髄ペルオキシダーゼ抗好中球細胞質抗体関連血管炎(MPO-AAV)の病理学的特徴である。細胞外デオキシリボ核酸(ecDNA)は、アポトーシス、壊死、ネクロトーシス、好中球外細胞トラップ(NETs)およびピロトーシスを含む細胞死の異なる形態の間に放出される。この細胞死の測定は、細胞死の異なる生化学的形態を同定するために必要ないくつかの異なるバイオマーカーで時間がかかる。ecDNAの測定は、一般に、病的損傷が起こる実際の標的器官ではなく、腎損傷の代理として血清および尿において行われる。腎臓のecDNAを調査する上で現在の難しさは、実験的およびアーカイブされたヒト腎臓生検の両方でホルマリン固定パラフィン埋め込み組織(FFPE)の方法の欠如である。このプロトコルは、FFPE組織(ヒトとマウスの両方)でecDNAを染色し、自家蛍光をクエンチし、一般に公開されているオープンソースImageJプラグインのトレーニング可能なWekaセグメンテーションから機械学習ツールを使用して、結果の画像中のecDNAを測定するために必要なステップの概要を提供します。トレーニング可能な Weka セグメンテーションは、プログラムが ecDNA を分類することを学習する糸球体の中の ecDNA に適用されます。この分類器は、後に取得した腎臓画像に適用され、個々の画像の手動注釈の必要性を減らします。トレーニング可能なWekaセグメンテーションの適応性は、実験的なマウス抗MPO糸球体腎炎(GN)から腎臓組織においてさらに実証され、NETおよびecMPOを同定し、抗MPOGNに共通の病理学的寄与者である。この方法は、トレーニング可能なWekaセグメンテーションプログラムが健康な正常な腎臓組織と病気の腎臓組織との間でecDNAを区別できる有効性を明らかに示す腎臓組織におけるecDNAの客観的な分析を提供する。このプロトコルは、他の臓器のecDNA、NETおよびecMPOを同定するために容易に適応することができる。
Introduction
骨髄ペルオキシダーゼ抗好中球細胞質抗体関連血管炎(MPO-AAV)は、腺球体損傷による腎不全を有する自己免疫疾患であり、相当な細胞死および脱酸性ビオ核酸(DNA)1、2。1,2DNAは、危険信号として機能することによって免疫系を活性化することができます。正常な健康な条件下では、DNAの核位置は免疫系への暴露からの保護を提供する。病原性プロセスまたは自己免疫の間に細胞外に放出される自己DNAは、免疫系によって、分子自己タンパク質(DAMP)3に関連する強力な炎症障害として見られる。細胞外DNA(ecDNA)は、アポトーシス、ネクロトーシス好中球外細胞トラップ形成(NETs)、壊死またはピロプトーシス4,4、5、6、7、8などの異なる生化学的経路によって支配されるいくつかの異なるメカニズムを介して死細胞から放出される。5,6,7,8
我々は、MPO-AAV99,1010の患者からの実験的抗MPO GNおよび腎臓生検からホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)腎臓のセクションで死細胞から放出されるecDNAを染色および測定する方法をここに記載する。血清および尿の両方から、およびインビトロアッセイ11,12から循環二本鎖DNA(dsDNA)およびDNA複合体を検出するための複数の方法が12存在する。これらの方法は、ecDNAの量を決定する際に正確であるが、ecDNAが解剖学的に放出される場所を決定しない。アポトーシスのためのチューンルや細胞デブリの測定などのecDNAの特異的測定を記述する方法があります13,,14.病的損傷が起こるFFPE腎臓におけるあらゆる形態の細胞死から最高潮に達したecDNAの測定を記述する方法はない。これは、実験的治療が実際の標的器官の病的傷害部位からecDNAをクリアしているかどうかを判断するために重要である。
腎臓サンプルから複数の画像を取得すると、1人のユーザーによって一般的に分析される大量のデータが作成されます。これは、労力がかかり、時間がかかり、ユーザーの偏見のために、他のユーザーが信頼性の低い再現性を受ける可能性があります。トレーニング可能な Weka セグメンテーションは、機械学習アルゴリズム15,,16を使用してピクセルを分類するために最先端のバイオインフォマティクスツールを使用する ImageJ 用のオープンソースソフトウェアプラグインです。この方法は、ユーザーのピクセルのセグメントの分類から学習し、新しい学習した分類を他の画像に適用する「トレーニング可能」です。この方法は、特定の「クラス」に属するものとしてセグメント内の各ピクセルを「分類」するために使用される ImageJ プログラム内の一般的な分析ツールに依存します。プログラムが「分類子」を学習すると、同じ画像内の他の類似した分類セグメントを識別するために使用できます。このモデルは、同じ実験内の他の画像セットに保存され、適用されます。
腎臓切片におけるその場でのecDNAの決定に対する現在の障害は、ホルマリンにおける固定からの内因性自己蛍光と画像の労働集約的な分析である。ここでは、この自己蛍光を消し止め、ecDNAを検出し、ecDNAの高スループット測定のための教師付き機械学習を使用する方法について説明します。我々は、以前に、ImageJのマクロを用いてNETおよび細胞外MPO(ecMPO)の測定を公表し、今では、教師付き機械学習1を用いてこれらの方法の半自動化を実証する。同じ画像内でNETとecMPOの代替染色を分類するために、機械学習ツールの適応性を実証します。ecDNA、NETおよびecMPOを検出するためにここで説明するこれらの染色法は、ecDNA、NETSおよびecMPOが関節リウマチおよびルプス17,18,18などの永続的疾患において役割を果たす他の固体器官および疾患に翻訳することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
糸球体腎炎の患者およびマウスモデルの血清および尿中の炎症促進マーカーを測定する複数のプロトコルが存在する。この記述されたプロトコルは糸球体の中の細胞死の産物(ecDNA、NETおよびecMPO)を直接分析することを可能にする。このプロトコルの最も重要なステップは、組織の準備とイメージングです。蛍光染色法を用いて分析する主な制限要素は、組織自家蛍光です。ホルマリン固定パ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、ニコンC1直立共焦点レーザー走査顕微鏡と腎臓組織の処理のためのモナッシュ組織学プラットフォームの使用のためのモナッシュマイクロイメージングを認める。
Materials
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25×75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
References
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
- Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
- Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
- Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
- Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
- Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
- Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
- Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
- Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
- Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
- Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).
