Här presenteras ett protokoll för att bedöma biventrikulär hjärtfunktion hos möss genom att generera tryck-volymslingor (PV) från höger och vänster kammare i samma djur med hjälp av sluten bröstkateterisering. Fokus ligger på den tekniska aspekten av kirurgi och datainsamling.
Bedömning av hjärtfunktion är avgörande för att bedriva kardiovaskulär och lungvaskulär preklinisk forskning. Tryck-volymslingor (PV-loopar) som genereras genom att registrera både tryck och volym under hjärtkateterisering är viktiga vid bedömning av både systolisk och diastolisk hjärtfunktion. Vänster och höger hjärtfunktion är nära besläktade, vilket återspeglas i det ömsesidiga beroendet mellan kamrarna. Att registrera biventrikulär funktion hos samma djur är därför viktigt för att få en fullständig bedömning av hjärtfunktionen. I detta protokoll används en sluten bröstkorg för hjärtkateterisering som överensstämmer med hur kateterisering utförs på patienter på möss. Även om det är en utmaning är strategin med stängd bröstkorg ett mer fysiologiskt tillvägagångssätt, eftersom öppning av bröstkorgen resulterar i stora förändringar i för- och efterbelastning som skapar artefakter, framför allt ett fall i systemiskt blodtryck. Högupplöst ekokardiografi används för att bedöma gnagare, men hjärtkateterisering är ovärderlig, särskilt vid bedömning av diastoliskt tryck i båda kamrarna.
Här beskrivs en procedur för att utföra invasiva, slutna bröstkorgar, sekventiella tryck-volym-loopar för vänster och höger kammare (PV) på samma djur. Solcellsslingor förvärvas med hjälp av admittansteknik med en mustryck-volymkateter och tryck-volymsystem-insamling. Proceduren beskrivs, från halsdissektionen, som krävs för att komma åt den högra halsvenen och den högra halspulsådern, till införandet och placeringen av katetern och slutligen datainsamlingen. Därefter diskuteras de kriterier som krävs för att säkerställa förvärv av högkvalitativa solcellsslingor. Slutligen beskrivs kortfattat analysen av PV-slingorna i vänster och höger kammare och de olika hemodynamiska parametrar som finns tillgängliga för att kvantifiera systolisk och diastolisk ventrikulär funktion.
Enligt Världshälsoorganisationen (WHO) är hjärtsjukdomar den vanligaste dödsorsaken i världen för både män och kvinnor 1,2,3. Många studier fokuserar på att diagnostisera och förbättra nedsatt hjärtfunktion4. För dessa tillämpningar är högkvalitativ och reproducerbar utvärdering av hjärtfunktionen avgörande. Tillförlitliga och reproducerbara kateterdata krävs för att bedöma både etiologiska och terapeutiska svar. Till exempel är bedömning av hjärtfunktion avgörande för att utvärdera effekten av läkemedel och andra behandlingar i prekliniska modeller av hjärtinfarkt5. Medan många kardiovaskulära studier fokuserar på vänsterkammarfunktion, är högerkammarfunktion också en avgörande faktor för funktionsförmåga och prognos hos patienter med lung-kärlsjukdom 6,7. Hos patienter med avancerad hjärtsvikt är ihållande förhöjt högersidigt och vänstersidigt fyllnadstryck prediktivt för den kombinerade risken för död, kardiovaskulär sjukhusvistelse och hjärttransplantation8. Vid kombinerad aorta- och mitralisklaffsjukdom är preoperativ myokardfunktion (återspeglas i parametrar som hjärtindex och ejektionsfraktion i vänster kammare) den huvudsakliga prediktorn för långtidsöverlevnad9. Högerkammarfunktion är den viktigaste prediktorn för både morbiditet och mortalitet vid pulmonell arteriell hypertension10,11. Således är bedömning av högerkammarfunktionen en nödvändig komponent i en omfattande preklinisk studie med modeller av pulmonell arteriell hypertension12,13,14.
Vänster- och högerkammarfunktionen studeras ofta oberoende av varandra. Men eftersom funktionerna i vänster och höger kammare är intimt sammankopplade är det idealiskt att få en biventrikulär bedömning av systolisk och diastolisk funktion från ett enda test15. Till exempel delar höger kammare sneda fibrer i den interventrikulära skiljeväggen med vänster kammare, vilket utgör en av de mekaniska länkarna mellan vänster och höger kammares kontraktila funktion16,17. Detta fenomen, känt som systolisk ventrikulär interaktion, gör att vänsterkammarkontraktion kan förstärka högerkammarkontraktionen. Ventrikulära interaktioner under diastole är också viktiga. Under diastole påverkar volymen av en kammare volymen av den motsatta kammaren och förändrar därmed diastolisk följsamhet och preload18,19. Vid patologiska tillstånd kan nedsatt funktion i en kammare, eller nedsatt volymbelastning, direkt eller indirekt försämra funktionen i den andra kammaren20. Som en konsekvens av systolisk ventrikulär interaktion kan en global minskning av vänsterkammarfunktionen minska högerkammarens kontraktila funktion15. Hos patienter med hjärtsvikt på grund av systolisk vänsterkammarfunktion och förhöjt diastoliskt tryck är lungartärtrycket förhöjt, vilket indirekt ökar efterbelastningen av höger kammare21,22. Omvänt utövar ökat högerkammartryck och volymöverbelastning vid svår pulmonell hypertension en mekanisk kompression på vänster hjärta. Denna D-formade tillplattning av vänster kammare, orsakad av en vänsterförskjutning i den interventrikulära skiljeväggen, minskar vänsterkammarvolymerna och försämrad systolisk och diastolisk funktion 23,24,25,26,27. Således är bedömningen av både vänster och höger kammare avgörande för att utvärdera global hjärtfunktion i prekliniska modeller av mänskliga sjukdomar.
Hjärtfunktionen kan också bedömas med icke-invasiv ekokardiografi, magnetisk resonanstomografi (MRT) och invasiv kateterisering28,29,30. Ekokardiografi är den vanligaste avbildningsmodaliteten inom kardiovaskulär forskning eftersom den är relativt billig och tillgänglig31. Ekokardiografi har dock flera tekniska begränsningar, bland annat indirekt mätning av fyllnadstryck och begränsad förmåga att kvantifiera diastolisk funktion. Dessutom är kvaliteten på de data som erhålls genom ekokardiografi i hög grad operatörsberoende. Hjärt-MR är ett relativt nytt tillskott till prekliniskt avbildningsarsenal som har stor potential för kvantitativ bedömning av biventrikulär funktion. Kvantifiering med hjärt-MRT är korrekt, eftersom den inte gör geometriska antaganden om ventrikulär form, till skillnad från ekokardiografi32. MR-avbildningsplattformen är dock dyr och är sällan tillgänglig. Dessutom kräver bearbetningen av MRT-data kompetent stöd av en fysiker eller motsvarande forskare, vilket saknas i många prekliniska laboratorier33. På samma sätt ger användningen av mikrodatortomografi (MicroCT) i prekliniska studier kvantitativa högupplösta tredimensionella (3D) anatomiska data som kan erhållas icke-invasivt, vilket möjliggör longitudinella studier34. MikroCT-avbildning kräver dock injektion av kontrastmedel, som ofta är dyra. MicroCT-bildbehandlingsplattformen, liksom MRI, är också dyr och kräver också en skicklig tekniker.
Kateterisering är däremot en invasiv teknik som innebär att en kateter förs in i höger och/eller vänster kammare för att mäta tryck och/eller volym. De verktyg som krävs för att utföra hjärtkateterisering är inte lika dyra som ekokardiografi, CT eller MRT. Betydande teknisk kompetens för kateterisering och smådjursanestesi krävs dock. Kateterisering möjliggör direkta och noggranna bedömningar av hjärtfunktionen28. I detta protokoll används en PV-kateter för att bedöma hjärtfunktionen. Denna teknik, baserad på de distinkta elektriska konduktansegenskaperna hos blod och hjärtmuskel, möjliggör samtidig registrering av tryck och volym i hjärthålan och generering av PV-slingor i realtid 5,35. Kortfattat består katetern av både excitationselektroder och registrerande elektroder. Excitationselektroderna genererar ett elektriskt fält inuti höger eller vänster kammare. Den inre inspelningselektroden mäter spänningsförändring, som är proportionell mot en förändring i motstånd. Att härleda ventrikelvolymen baseras på Ohms lag (spänning = ström x resistans) från vilken konduktans (dvs. inversen av resistans) beräknas. I denna inställning är det uppmätta konduktansvärdet en kombination av blodkonduktans och muskelkonduktans. I det elektriska fältet är blodet rent resistivt medan muskler har både kapacitiva och resistiva egenskaper. Muskelns kapacitiva egenskap orsakar en tidsfördröjning i den uppmätta signalen. Genom att spåra denna fördröjning, känd som “fasvinkeln”, rapporteras hjärtvävnadens intrång i fältet när hjärtat drar ihop sig. Detta mått är störst vid systole och lägst vid diastole. Denna egenskap gör det möjligt att separera muskelkomponenten i konduktansen från den i blod och möjliggör en nära approximation av absoluta systoliska och diastoliska volymer. Tryck-volymslingor ger en rad hemodynamiska parametrar som inte är lätta att mäta med andra metoder, till exempel enkel retrograd kateterisering med vätskefyllda katetrar för att mäta hjärttryck. Tryck-volymslingor mäter kammartryck men ger också data om kontraktilitet, elastans, effekt, energi och effektivitet. Dessutom ger solcellsslingor robusta kvantitativa mätningar36. Bedömning av hjärtfunktion med hjälp av PV-slingor som genereras av kateterisering har därför blivit den gyllene standarden inom preklinisk forskning37. Dessutom är prekliniska tekniker relevanta för sjukdomar hos människa där hjärtkateterisering, om än med vätskefyllda katetrar, är vanligt. Hjärtkateterisering hos gnagare kräver dock oklanderlig anestesi och utmärkt teknik för att förhindra överdriven blodförlust, hypoventilation eller förändringar i kroppstemperaturen.
Hos patienter utförs hjärtkateterisering i sluten bröstkorg och vaskulär åtkomst uppnås via halsvenen eller nyckelbensvenen för höger kammare och radial- eller lårbensartären för vänster kammare. På grund av mössens ringa storlek är metoden med stängd bröstkorg ofta utmanande. Studier som utförs på möss använder därför ofta en öppen bröstkorg. Denna teknik innebär att bröstkorgen öppnas, vilket exponerar hjärtat och underlättar införandet av katetern genom punktion av vänster och/eller höger kammares apex38. Även om detta tillvägagångssätt är tekniskt mindre utmanande och ganska reproducerbart, inkluderar dess största begränsningar blödning och andra komplikationer av apikal insättning av katetrar, och en markant minskning av intrakardiellt tryck till följd av att brösthålan öppnas för atmosfärstryck. Öppning av bröstkorgen hos en ventilerad gnagare inducerar en minskning av det systoliska trycket i vänster kammare med 5–10 mm Hg och en minskning av trycket i höger kammare med 2–5 mm Hg39. Därför utvecklades en sluten bröstkorg som är mindre traumatisk för hjärtat och ger mer fysiologiskt relevanta mätningar som lättare kan översättas till klinisk bedömning av hjärtfunktionen.
Bedömning av hjärtfunktion är ett kritiskt steg för preklinisk kardiovaskulär och lungvaskulär forskning. I detta arbete föreslog vi ett protokoll för en sluten bröstkorgsbiventrikulär bedömning av hjärtfunktionen hos möss. Genom detta tillvägagångssätt kan man generera PV-slingor för höger kammare och vänster kammare i samma mus. Detta tillvägagångssätt ger en robust och fullständig bedömning av hjärtfunktionen, vilket möjliggör mätning av systolisk och diastolisk funktion, såväl som slagvolym och hjärtminutvolym. Till skillnad från den öppna bröstkorgen som traditionellt används för kateterisering av gnagare, resulterar denna slutna bröstteknik i stabilare fysiologi och mer fysiologiskt relevanta data. Även om det är tekniskt mer utmanande och beroende av operatörens skicklighet för att framgångsrikt placera katetern i höger och vänster kammare, begränsar den slutna bröstkorgen det trauma och den blödning som är förknippad med öppen bröstkirurgi och minskar de drastiska tryckförändringar som är förknippade med att utsätta lungorna för atmosfärstryck. Metoden med sluten bröstkorg efterliknar också bättre den hjärtkateteriseringsprocedur som utförs på patienter, vilket ökar relevansen av att använda denna teknik i preklinisk forskning.
Det kirurgiska ingreppet är det kritiska steget i protokollet. Även när du använder ett kirurgiskt mikroskop för kateterinsättning i halsvenen eller halspulsådern, vilket rekommenderas, kräver denna procedur övning och teknisk skicklighet. Noggrann dissektion av kärlen fria från omgivande fascia med hjälp av skonsam, trubbig dissektion kommer att öka framgången med kanylering samtidigt som risken för blödning minimeras. För att minimera blodförlusten är det viktigt att kanylera halspulsådern i sekventiella steg: 1) för in kateterspetsen i halspulsådern; 2) Knyt försiktigt suturen runt den del av artären som innehåller katetern. 3) Släpp den säkra suturen, så att katetern kan röra sig samtidigt som du bibehåller en försiktig dragning uppåt för att minimera blödningen. och 4) för katetern till aortan. Placeringen av katetern i ventrikeln, som bestäms av vågformsövervakning i realtid, är den mest utmanande delen av detta protokoll. Alla kateterelektroder ska vara i ventrikelhålan och ingen ska vidröra väggen. All felaktig placering av katetern kommer att resultera i oregelbundna PV-slingor och kommer att påverka eller förhindra datainsamling negativt. Att känna igen den karakteristiska tryck-volym-vågformen som är resultatet av att ha alla elektroder i kammaren gör att man kan vara säker på en lämplig kateterposition. Det är viktigt att få en stabil ventrikulär tryckvågform och stabila tryckstorleksslingor innan du växlar till PV-läge och volymförvärv. Korrekt kunskap om hjärtats fysiologi och anatomi är avgörande för att lyckas med denna procedur. Onlineavläsning av PV-spåren, från förmaket, trikuspidalklaffområdet och höger kammare, kommer att visa kateterns framfart och hjälpa till att uppnå korrekt positionering. Det är viktigt att känna till den normala hjärtfrekvensen (400–600 slag per minut) och förväntade vågformer och tryck (t.ex. systoliskt tryck i höger kammare, 18–25 mm Hg, diastoliskt tryck <5 mm Hg; systoliskt tryck i vänster kammare 60–120 mm Hg40, diastoliskt tryck <8 mmHg) hos möss för att göra det möjligt för operatören att utvärdera sanningshalten i observerade data.
Kvaliteten och reproducerbarheten av data beror på procedurens hastighet och blodförlust eller blödning. Proceduren från anestesi till slutförande av datainsamling tar i genomsnitt ~30–40 min/mus. Kateterisering av höger hjärta från införandet av katetern till datainsamling tar 5–10 minuter, kateterisering av vänster hjärta från införandet av katetern till datainsamlingen tar ytterligare 10–15 minuter. Data av publikationskvalitet erhålls i ~75 % av fallen. Sekvensen av steg i hjärtkateteriseringen ska hållas konstant mellan djuren. Vid denna procedur intuberas mössen först, följt av högerkammarkateterisering och slutligen vänsterkammarkateterisering. Beslutet att gå vidare i denna ordning baseras på den större svårigheten och blödningsrisken vid kateterisering av vänster hjärta jämfört med höger hjärta. En ospecifik 50 Hz brusinspelningsartefakt kan observeras. Detta brus kan minskas med hjälp av ett FIR-filter med en hög avstängning vid 50 Hz och en låg avstängning på 0 på programvaran. För volymkanalen skapar du ett nytt kanal/filter/FIR-filter. Ett notchfilter på 50 Hz kan också användas under datainsamlingen för att eliminera nätbrus och ta bort eventuella radiofrekvensstörningar.
Ju snabbare kateteriseringen utförs, desto bättre blir kvaliteten på datan. Baserat på tidigare erfarenhet rekommenderas det att skaffa data inom 15 minuter. Ökad kateteriseringstid ökar den fysiologiska stressen på djuret och ökar risken för arytmi på grund av närvaron av katetern i kaviteten. Dessa krafter kan minska slagvolymen och försämra reproducerbarheten och tolkningsbarheten av vågformerna. Dessutom är kateterns spets vass och kan skada eller punktera kammaren. Detta är särskilt viktigt för höger kammare, som är ~ 1/3av tjockleken på vänster kammare.
Invasiv trakeostomi och mekanisk ventilation med positivt tryck resulterar i stabil och kontrollerad andning av mössen och minskar variabiliteten i PV-slingorna. Positivt slutexpiratoriskt tryck (PEEP) är dock en markant kontrast till normal ventilation, som är ett undertrycksfenomen. Tillsammans sänker övertrycksventilation och PEEP hjärtminutvolymen och sänker höger hjärttryck. Således, även om det krävs för att få stabila data, kommer mekanisk ventilation såväl som kardiodepressiva effekter av anestesin att påverka PV-slingorna och bör betraktas som en begränsning. Tillfälligt stopp av mekanisk ventilation under den korta inspelningen av PV-slingor används för att eliminera denna potentiella källa till artefakter. Observera att ventilationseffektiviteten kan bekräftas genom kapnografiövervakning av koldioxid.
De tekniska färdigheter som krävs för metoden med sluten bröstkorg kan vara en begränsning för denna teknik. På samma sätt är det svårt att få en korrekt och stabil placering av katetern i kammaren. Oddsen för att lyckas ökar med operatörens erfarenhet och med mössens storlek och vikt. Kateterisering av möss under 20 g är extremt utmanande. Den unika kammargeometrin i höger kammare kan påverka volymmätningen och bör övervägas. Det bedövningsmedel som används, hjärtfrekvens, temperatur och djurstam kan påverka de hemodynamiska parametrarna och bör rapporteras och övervakas noggrant.
Sammanfattningsvis utförs både höger- och vänsterkammarkateterisering i samma mus. Beroende på forskarens specifika mål kan vänster- eller högerkammarkateterisering utföras oberoende av varandra, med hjälp av den relevanta delen av det biventrikulära ingreppet. Det tillvägagångssätt som presenteras är dock optimalt för fullständig bedömning av hjärtfunktionen.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka för hjälpen och samarbetet från personalen på Queen’s Universitys djuranläggning. Författarna vill tacka för hjälpen från Austin Read, TMED MSc-kandidat.
Denna studie stöddes delvis av U.S. National Institutes of Health (NIH) anslag NIH 1R01HL113003-01A1 (S.L.A.), NIH 2R01HL071115-06A1 (S.L.A), Canada Foundation for Innovation och Queen’s Cardiopulmonary Unit (QCPU) 229252 och 33012 (SLA), Tier 1 Canada Research Chair in Mitochondrial Dynamics and Translational Medicine 950-229252 (S.L.A.), Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Foundation Grant CIHR FDN 143261, William J. Henderson Foundation (S.L.A.), Canadian Vascular Network Scholar Award (F.P.) och Paroian Family-stipendiet från Pulmonary Hypertension Association of Canada (F.P.)
ADVantage Pressure-Volume System (ADV500) | Transonic | FY097B | |
Endozime AW triple plus | Ruhof | 34521 | |
Fiber optic dual Gooseneck | Volpi Intralux | # 6000-1 | |
Forceps | F.S.T | 11052-10 | |
Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
Gauze sponges | Dermacea | 441400 | |
Hemostatic clamp | F.S.T | 13003-10 | |
Hemostatic clamp | F.S.T | 13018-14 | |
Heparin sodium | Sandoz | 023-3086 | 100 U/L |
High-fidelity admittance catheter | Scisence; Transonic | FTH-1212B-3518 | |
Isofluorane | Baxter | CA2L9108 | |
labScribe v4 software | iworx | LS-30PVL | |
Needle (30 gauge) | BD | 305106 | |
sodium chloride injection | Baxter | JB1309M | 0.9%(wt/vol) |
Stereo microscope | Cole-Parmer | OF-48920-10 | |
Surgical suture | SERAFLEX | ID158000 | black braided silk, 4.0 |
Surgical tape | 3M, Transpore | SN770 | |
Tabletop Single Animal Anesthesia Systems | Harvard apparatus | 72-6468 | |
Tracheotomy canula 1.45 mm diameter | Harvard apparatus | 72-1410 | |
Ventilator, far infrared warming pad for mice and rats PhysioSuite | Kent scientific corporation | # PS-02 |