Un'analisi planaria di Motility per misurare le proprietà biomodulanti dei prodotti naturali
Summary
La motilità planaria viene utilizzata per misurare le proprietà stimolanti e di ritiro dei prodotti naturali rispetto al movimento degli animali solo nell’acqua di sorgente.
Abstract
Viene descritto un mezzo semplice e controllabile per utilizzare il planariano non parassita, Dugesia tigrina, un verme piatto acquatico vivente, per studiare le proprietà stimolanti e di ritiro dei prodotti naturali. I saggi sperimentali che beneficiano di aspetti unici della fisiologia planaria sono stati applicati agli studi sulla guarigione delle ferite, la rigenerazione e la tumorigenesi. Inoltre, poiché i planari mostrano sensibilità a una varietà di stimoli ambientali e sono in grado di apprendere e sviluppare risposte condizionate, possono essere utilizzati in studi comportamentali che esaminano l’apprendimento e la memoria. I planari possiedono una simmetria bilaterale di base e un sistema nervoso centrale che utilizza sistemi di neurotrasmettitori su cui è possibile studi che esaminano gli effetti dei biomodulatori neuromuscolari. Di conseguenza, sono stati sviluppati sistemi sperimentali che monitorano il movimento planaria e la motilità per esaminare la dipendenza da sostanze e il ritiro. Poiché la motilità planaria offre il potenziale per un sistema di analisi della motilità sensibile e facilmente standardizzato per monitorare l’effetto degli stimoli, il test di velocità del locomotore planaria (pLmV) è stato adattato per monitorare sia i comportamenti di stimolazione che di ritiro da parte dei planari attraverso la determinazione del numero di linee di griglia attraversate dagli animali con il tempo. Qui, la tecnica e la sua applicazione sono dimostrati e spiegati.
Introduction
Il protocollo descritto utilizza la motilità planaria per fornire un mezzo per valutare gli effetti biomodulanti delle sostanze naturali. È stato specificamente adattato per determinare se queste sostanze funzionano come stimolanti, e se poi sono stati associati con un comportamento di astinenza misurabile1. Questo saggio, noto come il test di velocità locomotore planaria (pLmV), è stato utilizzato per testare noti agenti farmacologici2,3. L’applicazione di questo saggio planaria basato sulla motilità è da allora cresciuta in popolarità ed è stato adottato da diversi laboratori interessati a sostanze diverse dai prodottinaturali 4,5. Per questo esempio, un planariario viene posto in un piatto Petri contenente acqua di sorgente o acqua di sorgente contenente un biomodulatore disciolto. Poiché il piatto stesso è posto su carta millimetrata, il numero di linee della griglia attraversate dall’animale con il tempo mentre si muove sul contenitore può essere utilizzato per determinare la velocità di movimento in ogni condizione. Il test chiaro/scuro, altrimenti indicato come il test di preferenza posto condizionato (CPP), è un’altra variazione sul tema del monitoraggio della motilità planaria, e valuta quanto velocemente gli animali rispondono e migrano in un ambiente oscurato6,7. Il tracciamento video dei movimenti planari può anche essere analizzato utilizzando programmi informatici e il monitoraggio del centro di massa (COM)8,9,10,11.
L’utilizzo del planariano come modello animale per tali studi offre diversi vantaggi rispetto ad altri animali in quanto lo sperimentatore può facilmente controllare l’ambiente di analisi. In particolare, morire di fame i planariani prima della sperimentazione può impedire la loro esposizione ad altri agenti nutrizionali o farmacologici che potrebbero altrimenti confondere i risultati, e il biomodulatore specifico in esame può essere introdotto ai planari semplicemente aggiungendolo direttamente all’acqua di coltura, standardizzando così l’esposizione. Dal momento che i planari hanno un sistema nervoso e neurotrasmettitori che ricordano gli animali di ordine superiore, la fisiologia e le risposte sperimentali di questi animali agli stimoli neuromuscolari sono considerati biologicamente rilevanti per altri organismi12,13,14,15,16. Inoltre, poiché i planari sono relativamente economici e semplici da mantenere in laboratorio, offrono un modello biologico accessibile per molti ricercatori.
Come animale sperimentale, i planari sono adatti a una vasta gamma di studi. Ad esempio, il nostro gruppo, così come altri ricercatori utilizzano planariani per studiare la tumorigenesi17,18,19. I planariani presentano anche una serie di comportamenti di risposta agli stimoli chimici, termici, gravitazionali, elettrici, fotografici e magnetici che hanno costituito la base di altri sistemi di analisi. Alcuni di questi effetti sono stati utilizzati per studiare l’apprendimento e la memoria in questianimali 20,21,22,23,24,25,26,27. L’uso primario del modello planaria nella letteratura attualmente si concentra sull’attività delle cellule staminali pluripotenti planariari, chiamate neoblasti, e sul loro ruolo nellarigenerazione 28,29,30. Così, l’adozione del modello qui descritto consente un ulteriore studio utilizzando altri saggi a base planaria per fornire una comprensione più ampia di come i prodotti naturali e altri biomodulatori influenzano l’organismo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un semplice e accessibile analisi della motilità planaria è descritto per determinare gli effetti stimolanti e di ritiro dei prodotti naturali. Come modello comportamentale è necessario disporre di protocolli rigorosi per il movimento del punteggio e definizioni chiare di eventuali comportamenti per standardizzare le osservazioni tra diversi sperimentatori. Le idee presentate offrono una dimostrazione di come questo può essere raggiunto. Ogni laboratorio che utilizza questo protocollo deve adattare le informazioni pr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano riconoscere l’ufficio di promozione istituzionale, e la Morrisville College Foundation per una sovvenzione di pubblicazione a sostegno di questo lavoro, così come il SUNY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) per la loro assistenza continua e il sostegno della ricerca universitaria a SUNY Morrisville. Desideriamo anche ringraziare Sophia Hutchens per i commenti utili sulla tecnica descritta.
Materials
| Bottled Water – 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish – 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish – 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap – 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container – 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) – soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
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