Un ensayo de motilidad planarian para medir las propiedades biomodulantes de los productos naturales
Summary
La motilidad planaria se utiliza para medir las propiedades estimulantes y de abstinencia de los productos naturales en comparación con el movimiento de los animales solo en el agua de manantial.
Abstract
Se describe un medio sencillo y controlable de utilizar el planario no parásito, Dugesia tigrina, un gusano plano acuático de vida libre, para estudiar las propiedades estimulantes y de abstinencia de los productos naturales. Los ensayos experimentales que se benefician de aspectos únicos de la fisiología planaria se han aplicado a estudios sobre cicatrización de heridas, regeneración y tumorigenesis. Además, debido a que los planarios exhiben sensibilidad a una variedad de estímulos ambientales y son capaces de aprender y desarrollar respuestas condicionadas, se pueden utilizar en estudios conductuales que examinan el aprendizaje y la memoria. Los planarios poseen una simetría bilateral básica y un sistema nervioso central que utiliza sistemas de neurotransmisores susceptibles de estudios que examinan los efectos de los biomoduladores neuromusculares. En consecuencia, se han desarrollado sistemas experimentales de seguimiento del movimiento plano y la motilidad para examinar la adicción y la abstinencia de sustancias. Debido a que la motilidad planaria ofrece la posibilidad de un sistema de ensayo de motilidad sensible y fácilmente estandarizado para monitorear el efecto de los estímulos, la prueba de velocidad locomotora planaria (pLmV) fue adaptada para monitorear los comportamientos de estimulación y abstinencia por parte de planarios a través de la determinación del número de líneas de rejilla cruzadas por los animales con el tiempo. Aquí, la técnica y su aplicación se demuestran y explican.
Introduction
El protocolo descrito utiliza la motilidad planaria para proporcionar un medio de evaluar los efectos biomoduladores de las sustancias naturales. Se adaptó específicamente para determinar si estas sustancias funcionan como estimulantes, y si entonces se asociaron con un comportamiento de abstinencia mensurable1. Este ensayo, conocido como la prueba de velocidad del locomotor planorio (pLmV), se utilizó por primera vez para probar agentes farmacológicos conocidos2,3. La aplicación de este ensayo plano a base de motilidad ha crecido desde entonces en popularidad y ha sido adoptado por diferentes laboratorios interesados en sustancias distintas de los productos naturales4,,5. Para este ensayo, un planorio se coloca en un plato de Petri que contiene agua de manantial o agua de manantial que contiene un biomodulador disuelto. Debido a que el plato en sí se coloca en papel gráfico, el número de líneas de rejilla cruzadas por el animal con el tiempo a medida que se mueve alrededor del recipiente se puede utilizar para determinar la velocidad de movimiento en cada condición. La prueba de luz/oscuridad, también conocida como la prueba de preferencia de lugar condicionada (CPP), es otra variación en el tema de la supervisión de la motilidad planaria, y evalúa la rapidez con la que los animales responden y migran a un entorno oscuro6,,7. El seguimiento de vídeo de los movimientos planos también se puede analizar utilizando programas informáticos y seguimiento del centro de masa (COM)8,9,10,11.
El uso del planoario como modelo animal para tales estudios ofrece varias ventajas sobre otros animales en que el experimentador puede controlar fácilmente el entorno del ensayo. Específicamente, el hambre de los planarios antes de la experimentación puede impedir su exposición a otros agentes nutricionales o farmacológicos que de otro modo podrían confundir los resultados, y el biomodulador específico bajo investigación se puede introducir a los planarios simplemente agregándolo directamente al agua de cultivo, estandarizando así la exposición. Dado que los planarios tienen un sistema nervioso y neurotransmisores que recuerdan a los animales de orden superior, la fisiología y las respuestas experimentales de estos animales a los estímulos neuromusculares se consideran biológicamente relevantes para otros organismos12,,13,,14,,15,,16. Además, debido a que los planarios son relativamente baratos y sencillos de mantener en el laboratorio, ofrecen un modelo biológico accesible para muchos investigadores.
Como animal experimental, los planarios son adecuados para una amplia gama de estudios. Por ejemplo, nuestro grupo, así como otros investigadores utilizan planarios para estudiar la tumorigenesis17,18,19. Los planarios también exhiben una serie de comportamientos de respuesta a estímulos químicos, térmicos, gravitacionales, eléctricos, fotográficos y magnéticos que han formado la base de otros sistemas de ensayo. Algunos de estos efectos se han utilizado para estudiar el aprendizaje y la memoria en estos animales20,,21,22,23,24,25,26,27. El uso principal del modelo planario en la literatura en la actualidad se centra en la actividad de las células madre pluripotentes planarias, llamadas neoblastos, y su papel en la regeneración28,,29,,30. Por lo tanto, la adopción del modelo descrito aquí permite un estudio más profundo utilizando otros ensayos basados en planarios para proporcionar una comprensión más amplia de cómo los productos naturales y otros biomoduladores afectan al organismo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se describe un ensayo de motilidad planaria sencillo y accesible para determinar los efectos estimulantes y de abstinencia de los productos naturales. Como modelo de comportamiento es necesario tener protocolos estrictos para el movimiento de puntuación y definiciones claras de cualquier comportamiento para estandarizar las observaciones entre diferentes experimentadores. Las ideas presentadas ofrecen una demostración de cómo se puede lograr esto. Cada laboratorio que utilice este protocolo debe adaptar la informació…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer a la oficina de Avance Institucional, y a la Morrisville College Foundation por una subvención de publicación para apoyar este trabajo, así como al SunY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) por su asistencia continua y apoyo a la investigación de pregrado en SUNY Morrisville. También queremos agradecer a Sophia Hutchens por sus útiles comentarios sobre la técnica descrita.
Materials
| Bottled Water – 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish – 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish – 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap – 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container – 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) – soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
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