P. aeruginosa Anti-Enfektiflerin Klinik Öncesi Değerlendirilmesi Için Hava-Sıvı Arabiriminde Bronşiyal Epitel Hücrelerin in enfekte 3D Eş Kültür
Summary
Biz cfbe41o kullanarak enfekte hava yollarının üç boyutlu ortak kültür modeli için bir protokol tarif– hücreler, THP-1 makrofajlar, ve Pseudomonas aeruginosa, hava-sıvı arayüzü nde kurulan. Bu model aynı anda antibiyotik etkinliğini test etmek için yeni bir platform sağlar, epitel bariyer fonksiyonu, ve inflamatuar belirteçleri.
Abstract
akciğer enfeksiyonlarının tedavisi için fDrug araştırma yüksek karmaşıklık tahmine dayalı in vitro modellerdoğru ilerliyor. Akciğer modellerinde bakterilerin çok yönlü varlığı epitel dizilişi yeniden adapte edebilir, bağışıklık hücreleri mikroortamda bakterilere karşı inflamatuar bir yanıt koordine ederken. In vivo modelleri kistik fibrozis bağlamında yeni anti-enfektifleri test etmek için tercih olsa da, hala doğru insanlarda bu tür hastalıkların in vivo koşulları ve tedavi sonuçları taklit etmez. İnsan hücrelerine (bronşiyal epitel ve makrofajlar) ve ilgili patojenlere dayalı enfekte hava yollarının kompleks in vitro modelleri bu boşluğu kapatabilir ve yeni anti-enfektiflerin kliniğe çevrilmesini kolaylaştırabilir. Bu amaçla, insan kistik fibrozis bronkil epitel hücre hattı CFBE41o bir co-kültür modeli– ve THP-1 monosit kaynaklı makrofajlar, hava-sıvı arayüzü (ALI) koşullarda P. aeruginosa tarafından insan bronşiyal mukoza bir enfeksiyon taklit kurulmuştur. Bu model yedi gün içinde ayarlanır ve aşağıdaki parametreler aynı anda değerlendirilir: epitel bariyer bütünlüğü, makrofaj transmigration, bakteriyel sağkalım, ve inflamasyon. Bu protokol, yeni anti-enfektifleri keşfetmek ve akciğerlere aerosol dağıtımını optimize etmek için uygun olabilecek ilaç etkinliğini ve konak yanıtlarını değerlendirmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir sistemi tanımlar.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa kistik fibrozis ilgili bir patojen (CF) akciğer dokusubozukluğukatkıda 1. Aljinat ve diğer mukoid eksopolisakkaritler gibi polisakkaritlerin üretimi, inatçı bakteriyel yapışmayol açar hastalığın ilerlemesini koordine eder, bakterilere antibiyotik teslim sınırlar ve konak bağışıklık sistemine karşı bakterileri korur2. P. aeruginosa’nın planktonik evreden biyofilm oluşumuna geçişi bu bağlamda kritik bir konudur ve antibiyotik toleransının oluşmasını da kolaylaştırmaktadır.
CF bağlamında, fare öncelikle bir model olarak kullanılmıştır. Ancak fareler CF mutasyonları3’ündevreye girmesiyle bu hastalığa kendiliğinden yakalanmazlar. Bakteriyel biyofilm gelişimi ve ilaç duyarlılık çalışmalarının çoğu Petri kapları gibi abiyotik yüzeylerde yapılmıştır. Ancak, bu yaklaşım in vivo karmaşıklığı temsil etmez. Örneğin, önemli biyolojik engeller, bağışıklık hücreleri yanı sıra mukozal epitel de dahil olmak üzere yoktur. P. aeruginosa epitel hücreleri için oldukça toksik olmasına rağmen, bazı gruplar insan bronşiyal hücreleri ile daha önceki bir P. aeruginosa biyofilm yetiştirmek başardık. Bu hücreler CFTR mutasyonu olan kistik fibrozis hastalarından (CFBE41o– cells)4 kökenli ve antibiyotik etkinliğini değerlendirmek için izin5 veya enfeksiyon sırasında CFTR protein düzeltme değerlendirmek için izin6. Böyle bir model uyuşturucu etkinliğinin öngörülebilirliğini artırmak için gösterilmiştir, ilaç geliştirme sonraki aşamalarında başarısız ilaçlar ile sorunların karakterizasyonu sağlayan ek olarak7.
Ancak, akciğerde, mukozal epitel havaya maruz kalır. Ayrıca, doku makrofajları gibi solunum yollarında bulunan bağışıklık hücreleri, solunan patojenler veya parçacıklara karşı önemli bir rol oynamaktadır8. Makrofajlar bronşiyal lümen ulaşmak ve enfeksiyon mücadele için farklı hücre katmanları üzerinden göç. Ayrıca, inhale ilaçlar da pulmoner hava-kan bariyeri ek bir hücresel olmayan unsur olarak mukus varlığı ile başa çıkmak zorunda9. Nitekim, birkaç karmaşık üç boyutlu (3D) in vitro modeller geliştirilmiştir, in vivo alaka artırmak amacıyla. Ortak kültür sistemleri sadece ilaç keşfi için in vitro sistemlerin karmaşıklığını artırmakla kalmıyor, aynı zamanda hücre-hücre etkileşimlerini de incelemeyi mümkün kılmasını sağlıyor. Bu tür karmaşıklık makrofaj göçü ile ilgili çalışmalarda ele alınmıştır10, nötrofiller tarafından antimikrobiyal peptidlerin serbest bırakılması11, enfeksiyonda mukus rolü9, ve aşırı hasara epitel hücre reaksiyonu12. Ancak, cf genetik mutasyon özellikleri güvenilir bir CF enfekte in vitro modeli, havaya maruz kalan (artan fizyolojik durum), ve bağışıklık hücreleri entegre hala eksik.
Bu boşluğu kapatmak için, enfekte hava yollarının istikrarlı insan 3D eş kültürü için bir protokol uyguluyoruz. Model insan CF bronşiyal epitel hücreleri ve makrofajlar oluşur, P. aeruginosa ile enfekte ve hem difüzyonel hem de immünolojik bariyer temsil yeteneğine sahip. Anti-enfektifleri makul derecede yüksek iş kaynağında test etmek amacıyla, bu ortak kültür iyi plaka kesici uçların geçirilebilir filtre zarı üzerinde iki insan hücresi hattı kullanılarak kurulmuştur: CFBE41o– ve THP-1 monosit türevi makrofajlar. Ayrıca, sonunda aerosolize anti-enfektifler birikimi çalışmaiçin 13, model hava-sıvı arayüzü (ALI) yerine sıvı kaplı koşullar (LCC) kurulmuştur.
Burada rapor olarak, Bu model sadece bir antibiyotik tedavisi üzerine bakteriyel sağkalım değil, aynı zamanda hücre sitotoksisitesi, epitel bariyer bütünlüğü, makrofaj transmigration ve inflamatuar yanıtları, ilaç gelişimi için gerekli parametreler olan değerlendirme sağlar.
Bu protokol pulmoner hava yollarının inhalasyon tedavisi için iki ilgili hücre tipini biraraya getirir: makrofajlar ve CF bronşiyal epitel. Bu hücreler geçirilme destek uçlarının zıt taraflarında tohumlanır ve hücrenin havaya maruz kalmasına izin verir (hava-sıvı arabirimi (ALI) koşulları olarak adlandırılır. Konak hücrelerin bu co-kültür daha sonra P. aeruginosaile enfekte . Her iki konak hücre hatları insan kökenlidir: epitel hücreleri kistik fibrozis bronşiyal epitel temsil, CF kanalında bir mutasyon ile (CFBE41o–), ve THP-114 hücreleri iyi karakterize makrofaj benzeri hücre hattı vardır. Makrofaj benzeri hücreler karşı bölmeye eklenmeden önce kuyu plaka uçlarının üst tarafında bir konfluent epitel tabakasının oluşmasına izin verilir. ALI’de ortak kültür kurulduktan sonra sistem apikal tarafta P. aeruginosa ile aşılanır. Bu enfekte co-kültür sistemi daha sonra bir antibiyotik etkinliğini değerlendirmek için kullanılır, örneğin tobramisin. Aşağıdaki son noktalar analiz edilir: transepitelyal elektrikdirenci (TEER), hücre-hücre ve hücre-bakteri etkileşimlerinin konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) ile görselleştirilmesi, koloni oluşturan birimlerin (CFU) sayılarak bakterisel sağkalım, konak hücre sağkalım (sitotoksisite) ve sitokin salınımı açısından epitel bariyer bütünlüğü.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda enfekte hava yollarının 3Boyutlu ortak kültür için bir protokol açıklar, insan kistik fibrozis bronşiyal epitel hücre hattı CFBE41o tarafından oluşturulan- ve insan monosit kaynaklı makrofaj hücre hattı THP-1. Protokol, aynı anda ilaç etkinliği ve konak yanıtları test ederken önemli parametreler olan epitel bariyer bütünlüğü, makrofaj transmigration, bakteri sağkalım ve inflamasyon, değerlendirilmesi sağlar. Modeldeki yenilik, akut bakteriyel enfeksiyon (yani P. aeruginosa)</e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Avrupa Birliği’nin 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA – Tasarım ve Gelişmiş Nanoilaçların Geliştirilmesi ve Biyolojik Engelleri aşmak ve ağır hastalıkların tedavisi için hibe anlaşması kapsamında araştırma, teknolojik geliştirme ve gösteri için Avrupa Birliği’nin HORIZON 2020 Programı’ndan fon almıştır. Biz ortak kültür, Olga Hartwig, bilimsel illüstrasyon, Anja Honecker, ELISA tahliller için, Petra König, Jana Westhues ve Dr Chiara De Rossi hücre kültürü, analitik ve mikroscopy desteği için gelişimi büyük destek için Dr Ana Costa ve Dr Jenny Juntke teşekkür ederiz. Ayrıca chelsea Thorn’a makalemizi okuduğu için teşekkür ederiz.
Materials
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | – | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o– cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
References
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
- Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
- Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
- Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a., Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
- Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
- Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
- Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
- Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
- Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
- Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
- Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
- Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
- Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
- Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
- Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
- Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
- Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
- Daigneault, M., Preston, J. a., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
- Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution – A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
- Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis – where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
- Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
- Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O’Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
- Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. Nanomedicines for antimicrobial interventions. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).
- Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
- Ho, D. -. K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).
