P. aeruginosa Co-cultivo 3D infectado de células epiteliales bronquiales y macrófagos en la interfaz aire-líquido para la evaluación preclínica de los antiinfecciosos

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno relevante en la fibrosis quística (CF) que contribuye al deterioro del tejido pulmonar¹. La producción de polisacáridos, como el alginato y otros exopolísacáridos mucoides, coordina el progreso de la enfermedad, que conduce a la adherencia bacteriana tenaz, limita la entrega de antibióticos a las bacterias y protege las bacterias contra el sistema inmunitario huésped^2. La transición de P. aeruginosa de la etapa planctónica a la formación de biopelículas es un tema crítico en este contexto, facilitando también la aparición de tolerancia a antibióticos.

En el contexto de CF, el ratón se ha utilizado principalmente como modelo. Los ratones, sin embargo, no desarrollan espontáneamente esta enfermedad con la introducción de mutaciones DE CF³. La mayoría de los estudios de biopelícula bacteriana y susceptibilidad a fármacos se han realizado en superficies abióticas, como los platos Petri. Sin embargo, este enfoque no representa la complejidad in vivo. Por ejemplo, hay barreras biológicas importantes, incluidas las células inmunitarias, así como el epitelio mucoso. Aunque P. aeruginosa es bastante tóxico para las células epiteliales, algunos grupos han logrado co-cultivar un biofilm anterior de P. aeruginosa con células bronquiales humanas. Estas células se originaron en pacientes con fibrosis quística con mutación CFTR (CFBE41o^– células)⁴ y permitieron evaluar la eficacia de los antibióticos⁵ o evaluar la corrección de la proteína CFTR durante la infección⁶. Se demostró que este modelo mejora la previsibilidad de la eficacia de los fármacos, además de permitir la caracterización de problemas con fármacos que fracasaron en fases posteriores del desarrollo de fármacos⁷.

Sin embargo, en el pulmón, el epitelio muesca está expuesto al aire. Además, las células inmunitarias presentes en las vías respiratorias, como los macrófagos tisulares, desempeñan un papel esencial contra los patógenos o partículas inhalados^8. Los macrófagos migran a través de las diferentes capas celulares para alcanzar el lumen bronquial y combatir la infección. Además, los medicamentos inhalados también tienen que hacer frente a la presencia de moco como un elemento no celular adicional de la barrera pulmonar aire-sangre⁹. De hecho, se han desarrollado varios modelos tridimensionales complejos (3D) in vitro, con el objetivo de aumentar la relevancia in vivo. Los sistemas de co-cultivo no sólo aumentan la complejidad de los sistemas in vitro para el descubrimiento de fármacos, sino que también permiten estudiar las interacciones células celulares. Tal complejidad se ha abordado en estudios sobre la migración de macrófagos¹⁰, la liberación de péptidos antimicrobianos por neutrófilos¹¹, el papel de la mucosidad en la infección⁹, y la reacción de células epiteliales al daño excesivo¹². Sin embargo, todavía falta un modelo in vitro infectado por CF fiable que presenta la mutación genética en CF, que está expuesta al aire (aumento de la condición fisiológica), e integra las células inmunitarias.

Para cerrar esta brecha, describimos un protocolo para el co-cultivo humano estable en 3D de las vías respiratorias infectadas. El modelo está constituido por células epiteliales bronquiales y macrófagos humanos, infectados con P. aeruginosa y capaces de representar una barrera difusa e inmunológica. Con el objetivo de probar los antiinfecciosos a un rendimiento razonablemente alto, este co-cultivo se estableció en la membrana de filtro permeable de las plaquitas de pozos, utilizando dos líneas celulares humanas: CFBE41o^– y THP-1 monophages derivados de monocitos. Además, para estudiar finalmente la deposición de los antiinfecciosos aerosolizados¹³, el modelo se estableció en la interfaz aire-líquido (ALI) en lugar de en condiciones de cobertura líquida (LCC).

Como informamos aquí, este modelo permite evaluar no sólo la supervivencia bacteriana sobre un tratamiento antibiótico, sino también la citotoxicidad celular, la integridad de la barrera epitelial, la transmigración de macrófagos y las respuestas inflamatorias, que son parámetros esenciales para el desarrollo de fármacos.

Este protocolo combina dos tipos celulares relevantes para la terapia de inhalación de las vías respiratorias pulmonares: macrófagos y epitelio bronquial CF. Estas células se siembran en lados opuestos de inserciones de soporte permeables, lo que permite la exposición celular al aire (llamadas condiciones de interfaz aire-líquido (ALI). Este co-cultivo de células huésped se infecta posteriormente con P. aeruginosa. Ambas líneas celulares del huésped son de origen humano: las células epiteliales representan el epitelio bronquial de fibrosis quística, con una mutación en el canal CF (CFBE41o^–), y las células THP-1¹⁴ son una línea celular bien caracterizada similar a un macrófago. Primero se permite que una capa epitelial confluente se forme en la parte superior de las inserciones de placas de pozo antes de que las células similares a los macrófagos se añadan al compartimiento opuesto. Una vez establecida la cocultura en ALI, el sistema se inocula con P. aeruginosa en el lado apical. Este sistema de co-cultivo infectado se utiliza entonces para evaluar la eficacia de un antibiótico, por ejemplo, tobramicina. Se analizan los siguientes puntos finales: integridad de la barrera epitelial en términos de resistencia eléctrica transepitelial (TEER), visualización de interacciones células celulares y células-bacterias mediante microscopía de escaneo láser confocal (CLSM), supervivencia bacteriana mediante el recuento de unidades formadoras de colonias (CFU), supervivencia de células huésped (citotoxicidad) y liberación de citoquinas.