П. аэругиноза Зараженная 3D сокультура бронхиальных эпителиальных клеток и макрофагов при воздушно-жидком интерфейсе для доклинической оценки антиинфекционных элементов

Pseudomonas aeruginosa является соответствующим патогеном в муковисцидоз (CF), который способствует нарушению легочной ткани¹. Производство полисахаридов, таких как альгинат и другие слизистые экзополисахариды, координирует прогресс заболевания, что приводит к цепкой бактериальной приверженности, ограничивает доставку антибиотиков бактериям и защищает бактерии от иммунной системы хозяина². Переход P. aeruginosa от планктонной стадии к образованию биопленки является критическим вопросом в этом контексте, также способствуя возникновению толерантности к антибиотикам.

В контексте CF мышь в основном используется в качестве модели. Мыши, однако, не спонтанно развивать это заболевание с введением мутаций CF³. Большинство исследований бактериальной биопленки и восприимчивости к лекарственным препаратам проводились на абиотических поверхностях, таких как петри. Однако этот подход не представляет сложности in vivo. Например, отсутствуют важные биологические барьеры, включая иммунные клетки, а также мукозальный эпителий. Хотя P. aeruginosa довольно токсичен для эпителиальных клеток, некоторым группам удалось совместно культивировать более раннюю биопленку P. aeruginosa с человеческими бронхиальными клетками. Эти клетки возникли из муковисцидоза пациентов с мутацией CFTR (CFBE41o^– клетки)⁴ и позволило оценить эффективность антибиотиков⁵ или оценить коррекцию белка CFTR во время инфекции⁶. Такая модель была показана для улучшения предсказуемости эффективности препарата, в дополнение к характеристике проблем с препаратами, которые не в более поздних стадиях разработки препарата⁷.

Однако в легких слизистый эпителий подвергается воздействию воздуха. Кроме того, иммунные клетки, присутствующие в дыхательных путях, как и макрофаги тканей, играют важную роль против вдыханных патогенов или частиц^8. Макрофаги мигрируют через различные слои клеток, чтобы достичь бронхового просвета и бороться с инфекцией. Кроме того, вдыхаемые препараты также должны справиться с наличием слизи в качестве дополнительного неклеточного элемента легочного воздушно-кровавого барьера^9. Действительно, было разработано несколько сложных трехмерных (3D) моделей in vitro, направленных на повышение релевантности in vivo. Системы совместного культуры не только повышают сложность систем in vitro для обнаружения лекарств, но и позволяют изучать взаимодействие клеток и клеток. Такая сложность была решена в исследованиях о миграции макрофагов^10,высвобождении антимикробных пептидов нейтрофилами^11,роли слизи в инфекции^9,и эпителиальной клеточной реакции на чрезмерное повреждение^12. Тем не менее, надежная CF-инфицированная модель in vitro, которая имеет генетическую мутацию в CF, которая подвергается воздействию воздуха (увеличенное физиологическое состояние), и интегрирует иммунные клетки, все еще отсутствует.

Чтобы преодолеть этот разрыв, мы описываем протокол стабильной 3D-культуры инфицированных дыхательных путей. Модель состоит из бронхиальных эпителиальных клеток и макрофагов человека, инфицированных P. aeruginosa и способных представлять как диффузный, так и иммунологический барьер. С целью тестирования противоинфекционных при достаточно высокой пропускной способности, эта со-культура была установлена на проницаемой мембране фильтра хорошо пластины вставки, используя две линии клеток человека: CFBE41o^– и THP-1 моноцитов производных макрофагов. Кроме того, чтобы в конечном итоге изучить осаждение аэрозолизированных противоинфекционных¹³, модель была создана на воздухе жидкости интерфейс (ALI), а не жидкости покрытые условия (LCC).

Как мы сообщаем здесь, эта модель позволяет оценить не только выживаемость бактерий при лечении антибиотиками, но и цитотоксичность клеток, целостность эпителиального барьера, трансмиграцию макрофагов и воспалительные реакции, которые являются существенными параметрами для разработки лекарств.

Этот протокол сочетает в себе два соответствующих типа клеток для ингаляционной терапии легочных дыхательных путей: макрофаги и CF бронхиальный эпителий. Эти клетки посеяны на противоположных сторонах проницаемых опорных вставок, что позволяет клеточному воздействию воздуха (так называемые условия воздушно-жидкого интерфейса (ALI). Эта со-культура клеток-хозяев впоследствии заражена P. aeruginosa. Обе линии клеток-хозяев имеют человеческое происхождение: эпителиальные клетки представляют муковисцидоз бронхиального эпителия, с мутацией на канале CF (CFBE41o^–), и THP-1¹⁴ клетки хорошо характеризуется макрофагом, как клеточная линия. Слияние эпителиального слоя сначала допускается для формирования на верхней стороне хорошо пластины вставки до макрофагов, как клетки добавляются в противоположном отсеке. После того, как совместно культуры устанавливается в АЛИ, система прививается с P. aeruginosa на апсиа. Эта зараженная система совместной культуры затем используется для оценки эффективности антибиотика, например, тобрамицина. Анализируются следующие конечные точки: эпителиальная целостность барьера с точки зрения трансэпителиальной электрической резистентности (TEER), визуализация клеточно-клеточных и клеточно-бактериальных взаимодействий confocal лазерной сканирующей микроскопией (CLSM), бактериальное выживание путем подсчета колониообразующих единиц (CFU), выживаемость клеток-хозяев (цитотоксичность) и высвобождение цитокинов.