P. アフルギノーサ 抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー
Summary
我々は、CFBE41o-細胞、THP-1マクロファージ、および空気液体界面–で確立された緑膿菌を用いて、感染した気道の3次元共培養モデルのプロトコルについて説明する。このモデルは、抗生物質の有効性、上皮バリア機能、および炎症マーカーを同時にテストするための新しいプラットフォームを提供します。
Abstract
肺感染症の治療のためのfDrug研究は、高い複雑さのイン ビトロ モデルの予測に向かって進んでいます。肺モデルにおける細菌の多面的存在は上皮配列を再適応させることができ、免疫細胞は微小環境における細菌に対する炎症反応を調整する。 生体内 モデルは嚢胞性線維症の文脈で新しい抗感染薬をテストするための選択であったが、彼らはまだヒトにおけるそのような疾患の インビボ 状態および治療結果を正確に模倣していない。ヒト細胞(気管支上皮およびマクロファージ)および関連する病原体に基づく感染気道の複雑な in vitro モデルは、このギャップを埋め、新しい抗感染薬のクリニックへの翻訳を容易にする可能性がある。このような目的のために、ヒト嚢胞性線維症気管支上皮細胞株CFBE41oと THP-1単球由来マクロファージの共培養モデルが確立され、空気液体界面(ALI)状態における 緑化 症によるヒト気管支粘膜の感染を模倣した。このモデルは7日間で設定され、次のパラメータが同時に評価されます:上皮バリアの完全性、マクロファージの移行、細菌の生存、および炎症。本プロトコルは、新しい抗感染薬の発見と肺へのエアロゾル送達の最適化に関連する可能性のある薬物有効性および宿主応答を評価するための堅牢で再現可能なシステムを記述する。
Introduction
緑膿菌 は、肺組織障害に寄与する嚢胞性線維症(CF)に関連する病原体である。アルギン酸および他の粘液性エキソ多糖などの多糖類の生産は、粘り強い細菌の付着をもたらす疾患の進行を調整し、細菌への抗生物質の送達を制限し、宿主免疫系2に対して細菌を保護する。 P.緑素症 の段階からバイオフィルム形成への移行は、この文脈において重要な問題であり、また抗生物質耐性の発生を促進する。
CFのコンテキストでは、マウスは主にモデルとして使用されています。しかし、マウスはCF変異3の導入により、この疾患を自発的に発症しない。細菌バイオフィルムの開発および薬物感受性の研究のほとんどは、ペトリ皿などの生物的表面で行われてきた。ただし、この方法は in vivoの複雑さを表すものではありません。例えば、免疫細胞や粘膜上皮を含む重要な生物学的障壁は存在しない。P.緑素吸い道は上皮細胞に非常に有毒であるが、いくつかのグループは、ヒト気管支細胞と以前のP.緑素吸膜を共同培養することができました。これらの細胞は、CFTR突然変異を有する嚢胞性線維症患者(CFBE41o-細胞)4に由来し、抗生物質有効性5を評価するか、または感染時にCFTRタンパク質の補正を評価することを許可した6。–このようなモデルは、薬剤の有効性の予測可能性を向上させることが示されたが、薬剤開発の後の段階で失敗した薬物の問題の特徴付けを可能にすることに加えて7。
しかし、肺では、粘膜上皮が空気にさらされる。また、気道に存在する免疫細胞は、組織マクロファージのように、吸入病原体または粒子8に対して必須の役割を果たす。マクロファージは、気管支内腔に到達し、感染と戦うために異なる細胞層を介して移動します。さらに、吸入薬物はまた、肺空気・血液関門9の追加の非細胞元素としての粘液の存在に対処しなければならない。実際、インビボの関連性を高め、いくつかの複雑な3次元(3D)インビトロモデルが開発されました。共培養システムは、創薬のためのin vitroシステムの複雑さを高めるだけでなく、細胞と細胞の相互作用を研究することを可能にします。このような複雑さは、マクロファージ遊走10に関する研究において取り組み、好中球11による抗菌ペプチドの放出、感染における粘液の役割9、及び上皮細胞反応を過剰損傷12に対する。しかし、CFの遺伝子変異を特徴とする信頼性の高いCF感染型インビトロモデルは、空気にさらされ(生理学的状態が増加する)、免疫細胞を統合することは依然として欠けている。
このギャップを埋めるために、我々は、感染した気道の安定したヒト3D共培養のためのプロトコルを記述する。このモデルは、ヒトCF気管支上皮細胞およびマクロファージで構成され、P.緑内膜に感染し、拡散性および免疫学的障壁の両方を表すことができる。合理的に高いスループットで抗感染薬をテストするという目標を持つこの共培養は、2つのヒト細胞株CFBE41oとTHP-1単球由来マクロファージを使用して、–ウェルプレートインサートの透過性フィルター膜に確立されました。さらに、最終的にエアロゾル化抗感染剤13の沈着を研究するために、このモデルは液体被覆条件(LCC)ではなく空気液体界面(ALI)で確立された。
ここで報告するように、このモデルは、抗生物質治療時の細菌生存期間だけでなく、細胞毒性、上皮バリア完全性、マクロファージ転移、および薬物開発に不可欠な炎症反応を評価することを可能にする。
このプロトコルは、肺気道の吸入療法のための2つの関連する細胞タイプを組み合わせた:マクロファージとCF気管支上皮。これらの細胞は、透過性支持口の反対側に播種され、空気への細胞暴露を可能にする(空気/液体界面(ALI)条件と呼ばれる)。この宿主細胞の共培養は、その後、P.緑素吸い星に感染する。両方の宿主細胞株はヒト由来である:上皮細胞は嚢胞性線維症気管支上皮を表し、CFチャネル(CFBE41o-)に変異を有–し、THP-11414細胞は、よく特徴付けられたマクロファージ様細胞株である。コンフルエント上皮層は、マクロファージ様細胞が反対側のコンパートメントに加える前に、まずウェルプレート挿入物の上側に形成される。ALIで共培養が確立されると、システムは、アプリーカル側のP.緑素吸着で接種されます。この感染した共培養システムは、例えばトブラマイシンなどの抗生物質の有効性を評価するために使用される。次のエンドポイントを分析する:経上皮電気抵抗(TEER)の点で上皮バリア完全性、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)による細胞細胞および細胞細菌相互作用の可視化、コロニー形成単位(CFU)のカウントによる細菌生存、宿主細胞生存(細胞毒性)およびサイトカイン放出。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文は、ヒト嚢胞性線維症気管支上皮細胞株CFBE41o-およびヒト単球由来マクロファージ細胞株THP-1によって構成される、感染した気道の3D共培養のためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、上皮バリアの完全性、マクロファージの移行、細菌の生存、および炎症の評価を可能にし、薬物の有効性と宿主応答を同時に検査する際の重要なパラメータである。モデルにおける新規?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、欧州連合(EU)のHORIZON 2020プログラムから、補助金契約第642028 H2028-MSCA-ITN-2014、NABBA – 生物学的障壁を克服し、重篤な疾患を治療するための高度なナノ医薬品の設計と開発に基づく研究、技術開発、デモンストレーションのための資金を受け取りました。アナ・コスタ博士とジェニー・ユントケ博士は、ELISAアッセイ、ペトラ・ケーニッヒ、ジャナ・ウェストヒュース、キアラ・デ・ロッシ博士の細胞培養、分析、顕微鏡コピーに関するサポートに対する科学的イラスト「アンジャ・ホーネッカー」に対する共文化の発展に大きな支援をしてくれたことに感謝します。また、原稿を校正してくれたチェルシー・ソーンに感謝します。
Materials
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | – | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o– cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
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