פ. ארוגינוזה נגוע 3D שיתוף תרבות של תאים אפיתל הסיפונות מקרופאגים בממשק אוויר נוזלי להערכה פרה-סרטנית של אנטי זיהומים

פסאודומונס aeruginosa הוא פתוגן רלוונטי סיסטיק פיברוזיס (CF) שתורם ליקוי רקמת ריאה¹. הייצור של פוליסכרידים, כגון אלגינט ואקסופוליסכרידים אחרים, מתאם את התקדמות המחלה, מה שמוביל לדבקות חיידקים עקשנית, מגביל את אספקת אנטיביוטיקה לחיידקים ומגן על החיידקים מפני המערכת החיסונית^{המארחת 2}. המעבר של P. aeruginosa מהשלב פלנקטוני להיווצרות biofilm הוא נושא קריטי בהקשר זה, גם להקל על המופע של סובלנות לאנטיביוטיקה.

בהקשר של CF, העכבר שימש בעיקר כמודל. עכברים, עם זאת, לא באופן ספונטני לפתח מחלה זו עם המבוא של מוטציות CF³. רוב פיתוח הביופילם החיידקי ותרופות רגישות מחקרים בוצעו על משטחים abiotic, כגון צלי פטרי. עם זאת, גישה זו אינה מייצגת את מורכבות vivo. לדוגמה, מחסומים ביולוגיים חשובים נעדרים, כולל תאים חיסוניים, כמו גם אפיתל ריר. למרות P. aeruginosa הוא רעיל למדי לתאי אפיתל, כמה קבוצות הצליחו לטפח מוקדם P. aeruginosa biofilm עם תאים הסימונכיאליים האנושיים. תאים אלה מקורם חולי סיסטיק פיברוזיס עם מוטציה CFTR (CFBE41o^– תאים)^{4 ומותר} להעריך יעילות^{אנטיביוטית 5} או להעריך את התיקון של חלבון CFTR במהלך^{זיהום 6}. מודל כזה הוצג כדי לשפר את יכולת החיזוי של יעילות התרופה, בנוסף לאפשר אפיון של בעיות עם תרופות שנכשלו בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח תרופות⁷.

עם זאת, בריאה, אפיתל הריר חשוף לאוויר. יתר על כן, תאים חיסוניים נוכחים בדרכי הנשימה, כמו מקרופאגים רקמה, לשחק תפקיד חיוני נגד פתוגנים בשאיפה או^{חלקיקים 8}. מקרופאגים נודדים דרך שכבות התא השונות כדי להגיע לומן הסיפונות ולהילחם בזיהום. יתר על כן, תרופות בשאיפה גם צריך להתמודד עם הנוכחות של ריר כמרכיב נוסף שאינו תאי של מחסום דם האוויר^{ריאתי 9}. ואכן, פותחו מספר תלת מימד מורכבים (תלת מימד) בדגמי מבחנה, במטרה להגדיל את הרלוונטיות של vivo. מערכות שיתוף תרבות לא רק להגדיל את המורכבות של מערכות חוץ חוץ עבור גילוי סמים, אלא גם לאפשר ללמוד אינטראקציות תא. מורכבות כזו טופלה במחקרים על הגירה^{מקרופאג 10}, שחרור פפטידים מיקרוביאליים על ידי^{נויטרופילים 11}, התפקיד של^{ריר בזיהום 9}, ואת התגובה תא אפיתל לנזק^{מוגזם 12}. עם זאת, אמין CF נגוע במודל במבחנה הכולל את המוטציה הגנטית ב CF, כי הוא חשוף לאוויר (מצב פיזיולוגי מוגבר), ומשלב תאים חיסוניים עדיין חסר.

כדי לגשר על הפער הזה, אנו מתארים פרוטוקול לתרבות תלת-מית-מית-מית-אנושית יציבה של דרכי הנשימה הנגועות. המודל מורכב של תאי אפיתל סימונכיים CF אנושיים מקרופאגים, נגוע P. aeruginosa ומסוגל לייצג מחסום דיפוזיה ואימונולוגית. במטרה לבחון נוגדי זיהומים בתפוקה גבוהה למדי, תרבות משותפת זו הוקמה על קרום מסנן חדיר של תוספות צלחת באר, באמצעות שני קווי תאים אנושיים: CFBE41o^– ו מקרופאגים נגזר THP-1 מונוציט. יתר על כן, כדי ללמוד בסופו של דבר את התצהיר של^{תרסיס נגד זיהומים 13}, המודל הוקם בממשק האוויר נוזלי (ALI) ולא תנאים מכוסים נוזלי (LCC).

כפי שאנו מדווחים כאן, מודל זה מאפשר להעריך לא רק הישרדות חיידקים על טיפול אנטיביוטי, אלא גם ציטוקסיות תא, שלמות מחסום אפיתל, טרנסמיג מקרופאג, ותגובות דלקתיות, שהם פרמטרים חיוניים לפיתוח תרופות.

פרוטוקול זה משלב שני סוגי תאים רלוונטיים לטיפול בשאיפה של דרכי הנשימה הריאתיות: מקרופאגים ואפיליום סימפונות CF. תאים אלה נזרעים משני צדי המתוספה לתמיכה חדיר, ומאפשרים חשיפה לתא לאוויר (הנקרא תנאי ממשק נוזלי אוויר (ALI). תרבות זו של תאים מארחים נגועה לאחר מכן P. aeruginosa. שני קווי התא המארחים הם ממוצא אנושי: תאי האפיתל מייצגים את האפיתל הסימפונת סיסטיק פיברוזיס, עם מוטציה בערוץ CF (CFBE41o^–), ואת THP-1¹¹⁴ תאים הם קו תא מאופיין היטב דמוי מקרופאג. שכבת אפיתל confluent מותרת תחילה ליצור בצד העליון של מותב צלחת באר לפני תאים כמו מקרופאג מתווספים לתא הנגדי. לאחר שהתרבות ההתופת הוקמה ב-ALI, המערכת מחוסנת עם P. aeruginosa בצד apical. מערכת זו נגועה שיתוף תרבות משמש לאחר מכן כדי להעריך את היעילות של אנטיביוטיקה, למשל tobramycin. נקודות הקצה הבאות מנותחות: שלמות מחסום אפיתל במונחים של התנגדות חשמלית טרנסאפיתליאלית (TEER), הדמיה של תא תא ותאי-חיידקים אינטראקציות על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM), הישרדות חיידקים על ידי ספירה של יחידות יוצרי מושבה (CFU), הישרדות תאי מארח (cytotoxicity) ושחרור ציטוקינה.