P. aeruginosa Co-culture 3D infectée des cellules épithéliales bronchiques et des macrophages à l’interface air-liquide pour l’évaluation préclinique des anti-infectieux

Pseudomonas aeruginosa est un agent pathogène pertinent dans la mucoviscidose (CF) qui contribue à l’affaiblissement des tissus pulmonaires¹. La production de polysaccharides, tels que l’alginate et d’autres exopolysaccharides mucoïdes, coordonne la progression de la maladie, qui conduit à l’observance bactérienne tenace, limite la livraison d’antibiotiques aux bactéries et protège les bactéries contre le système immunitaire hôte². La transition de P. aeruginosa de l’étape planctonique à la formation de biofilm est un problème critique dans ce contexte, facilitant également l’apparition de la tolérance aux antibiotiques.

Dans le contexte des FC, la souris a été principalement utilisée comme modèle. Les souris, cependant, ne développent pas spontanément cette maladie avec l’introduction des mutations de CF³. La plupart des études sur le biofilm bactérien et la susceptibilité aux médicaments ont été réalisées sur des surfaces abiotiques, comme les boîtes de Pétri. Toutefois, cette approche ne représente pas la complexité in vivo. Par exemple, d’importantes barrières biologiques sont absentes, y compris les cellules immunitaires ainsi que l’épithélium muqueuse. Bien que P. aeruginosa soit très toxique pour les cellules épithéliales, certains groupes ont réussi à co-cultiver un biofilm P. aeruginosa plus tôt avec des cellules bronchiques humaines. Ces cellules provenaient de patients atteints de mucoviscidose présentant une mutation CFTR (CFBE41o^– cellules)⁴ et ont permis d’évaluer l’efficacité des antibiotiques⁵ ou d’évaluer la correction de la protéine CFTR pendant l’infection⁶. Un tel modèle a été montré pour améliorer la prévisibilité de l’efficacité des médicaments, en plus de permettre la caractérisation des problèmes avec les médicaments qui ont échoué dans les phases ultérieures du développement de médicaments⁷.

Cependant, dans le poumon, l’épithélium muqueuse est exposé à l’air. En outre, les cellules immunitaires présentes dans les voies respiratoires, comme les macrophages tissulaires, jouent un rôle essentiel contre les agents pathogènes inhalés ou les particules⁸. Les macrophages migrent à travers les différentes couches cellulaires pour atteindre le lumen bronchique et combattre l’infection. En outre, les médicaments inhalés doivent également faire face à la présence de mucus comme un élément non cellulaire supplémentaire de la barrière pulmonaire air-sang⁹. En effet, plusieurs modèles in vitro tridimensionnels complexes (3D) ont été développés, dans le but d’accroître la pertinence in vivo. Les systèmes de coculture augmentent non seulement la complexité des systèmes in vitro pour la découverte de médicaments, mais permettent également d’étudier les interactions cellule-cellule. Une telle complexité a été abordée dans des études sur la migration des macrophages¹⁰, la libération de peptides antimicrobiens par les neutrophiles¹¹, le rôle du mucus dans l’infection⁹, et la réaction épithéliale des cellules aux dommages excessifs¹². Cependant, un modèle in vitro fiable infecté par les FC qui présente la mutation génétique dans la FIBROSE, qui est exposée à l’air (condition physiologique accrue), et intègre les cellules immunitaires fait encore défaut.

Pour combler cet écart, nous décrivons un protocole pour la co-culture humaine stable 3D des voies respiratoires infectées. Le modèle est constitué de cellules et de macrophages épithéliales bronchiques cf humaine, infectées par P. aeruginosa et capables de représenter à la fois une barrière diffusionnelle et immunologique. Dans le but de tester des anti-infectieux à un débit raisonnablement élevé, cette co-culture a été établie sur la membrane filtrante perméable des inserts de plaque de puits, à l’aide de deux lignées cellulaires humaines : CFBE41o^– et macrophages dérivés de monocytes THP-1. En outre, pour étudier éventuellement le dépôt d’anti-infectieux aérosols¹³, le modèle a été établi à l’interface air-liquide (ALI) plutôt que dans des conditions couvertes par le liquide (LCC).

Comme nous le rapportons ici, ce modèle permet d’évaluer non seulement la survie bactérienne sur un traitement antibiotique, mais aussi la cytotoxicité cellulaire, l’intégrité de barrière épithéliale, la transmigration de macrophage, et les réponses inflammatoires, qui sont des paramètres essentiels pour le développement de drogue.

Ce protocole combine deux types de cellules pertinents pour la thérapie par inhalation des voies respiratoires pulmonaires : les macrophages et l’épithélium bronchique de CF. Ces cellules sont ensemencées sur les côtés opposés des inserts de support perméables, ce qui permet l’exposition cellulaire à l’air (appelé l’interface air-liquide (ALI) conditions). Cette co-culture des cellules hôtes est par la suite infectée par P. aeruginosa. Les deux lignées cellulaires hôtes sont d’origine humaine : les cellules épithéliales représentent l’épithélium bronchique de la fibrose kystique, avec une mutation sur le canal CF (CFBE41o^–), et les cellules THP-1¹⁴ sont une lignée cellulaire bien caractérisée comme un macrophages. Une couche épithéliale confluente est d’abord autorisée à se former sur le côté supérieur des inserts de plaque de puits avant que les cellules macrophage-like soient ajoutées au compartiment opposé. Une fois que la co-culture est établie à ALI, le système est inoculé avec P. aeruginosa du côté apical. Ce système de coculture infecté est ensuite utilisé pour évaluer l’efficacité d’un antibiotique, par exemple la tobramycine. Les points d’extrémité suivants sont analysés : intégrité des barrières épithéliales en termes de résistance électrique transépithéliale (TEER), visualisation des interactions cellule-cellule et cellule-bactériose par microscopie à balayage laser confocale (CLSM), survie bactérienne en comptant les unités de formation de colonies (CFU), survie des cellules hôtes (cytotoxicité) et libération de cytokine.