P. 阿鲁吉诺萨 气液界面中支气皮细胞和巨噬细胞的感染三维共培养，用于抗感染的临床前评估

伪多多多酸菌是 囊性纤维化（CF）中的相关病原体，有助于肺组织损伤^1。多糖的生产，如藻酸盐和其他粘液外聚糖，协调疾病的进展，这导致顽强的细菌坚持，限制抗生素向细菌的输送，并保护细菌免受宿主免疫系统^2。在这种情况下 ，P. aeruginosa从 浮游生物期过渡到生物膜形成是一个关键问题，也促进了抗生素耐受性的发生。

在 CF 的上下文中，鼠标主要用作模型。然而，小鼠不会自发地发展这种疾病与CF突变3的^引入。大多数细菌生物膜开发和药物易感性研究是在非生物表面进行的，如培养皿。但是，此方法并不表示体内的复杂性。例如，重要的生物屏障是不存在的，包括免疫细胞以及粘膜上皮。虽然P.aeruginosa对上皮细胞相当有毒，但一些团体已经成功地与人类支气管细胞共同培育了早期的P.aeruginosa生物膜。这些细胞起源于囊性纤维化患者与CFTR突变（CFBE41o^–细胞^）4，并允许评估抗生素疗效5或评估感染^期间CFTR蛋白的纠正^6。这种模式被证明可以提高药物疗效的可预测性，此外还能够对药物在药物开发后期阶段失败的问题进行^定性。

然而，在肺，粘膜上皮暴露在空气中。此外，存在于气道中的免疫细胞，如组织巨噬细胞，对吸入的病原体或颗粒8起起^{至关重要的作用}。巨噬细胞通过不同的细胞层迁移，到达支气管流明并对抗感染。此外，吸入的药物还必须应付粘液的存在作为肺气血屏障⁹的附加非细胞元素。事实上，已经开发了几个复杂的三 维 （3D）体外模型，旨在提高 体内的相关性 。联合培养系统不仅增加了药物发现 体外 系统的复杂性，而且能够研究细胞-细胞相互作用。这种复杂性在有关巨噬细胞迁移^10、中性粒细胞^{释放11、粘}液在感染中的作用^9、上皮细胞对过度损伤的反应等研究中已经^得到解决。然而，一个可靠的CF感染 体外 模型，功能在CF的基因突变，暴露在空气中（增加的生理条件），并整合免疫细胞仍然缺乏。

为了弥补这一差距，我们描述了一个协议，用于稳定受感染气道的人类3D共培养。该模型由人类CF支气管上皮细胞和巨噬细胞组成，感染了 P.aeruginosa， 能够代表扩散和免疫屏障。以在相当高的通量下测试抗感染物为目的，利用两种人类细胞系：CFBE41o^和 THP-1单细胞衍生巨噬细胞，在井板插入物的渗透滤膜上建立了这种共培养物。此外，为了最终研究气溶胶抗感染剂¹³的沉积，该模型是在空气-液体界面（ALI）而不是液体覆盖条件（LCC）建立的。

正如我们在这里报告，这个模型不仅允许评估抗生素治疗的细菌生存，而且允许评估细胞毒性，上皮屏障完整性，巨噬细胞转运和炎症反应，这些都是药物开发的基本参数。

该协议结合了两种相关的细胞类型，用于肺气道的吸入治疗：巨噬细胞和CF支气管上皮。这些细胞在可渗透支撑刀片的对面播种，允许细胞暴露在空气中（称为空气-液体接口（ALI）条件）。这种宿主细胞的共培养随后感染了 P.aeruginosa。两个宿主细胞系都是人类起源的：上皮细胞代表囊性纤维化支气管上皮，在CF通道（CFBE41o^{-）上发生突变}，THP-1¹⁴ 细胞是一个特征良好的巨噬细胞状细胞系。在将巨噬细胞样细胞添加到相反的隔间之前，首先允许在井板插入物的上侧形成汇合上皮层。一旦在ALI建立共同培养，系统就接种 了P.aeruginosa。 然后，这种受感染的联合培养系统用于评估抗生素的疗效，例如去布拉霉素。分析了以下终点：跨皮质电阻（TEER）、细胞和细胞-细菌相互作用的可视化、共生激光扫描显微镜（CLSM）、通过计数菌群形成单位（CFU）、宿主细胞生存（细胞毒性）和细胞因子释放的细菌存活率。