この鉄の酸化還元の種分法は、毛細管電気泳動誘導結合プラズマ質量分析とサンプルスタッキングを1回の実行で短い分析と組み合わせることに基づいています。この方法は、多様な組織および生体流体サンプルにわたる鉄の酸化還元種を迅速に分析し、定量の低い制限を提供します。
鉄代謝のジホメオスタシスは、癌およびいくつかの神経変性状態を含む多数の疾患の病態生理学的枠組みに説明される。過剰な鉄は遊離酸化活性Fe(II)をもたらし、酸化ストレス(OS)やフェロプト(FPT)として知られている脂質過酸化による死のような細胞内の壊滅的な効果を引き起こす可能性があります。したがって、Feの全定量ではなく鉄鉄(Fe(II))と鉄(Fe(III))の定量的測定が、これらの有害なプロセスをより詳しく調べるための鍵となります。Fe(II)/(III)の決定は、脳脊髄液(CSF)のような関連するサンプルの速いレドックス状態シフトと低濃度によって妨げられる可能性があるため、迅速に分析し、定量(LOQ)の低限界を提供する方法が利用可能であるべきです。キャピラリー電気泳動(CE)は、高速Fe(II)/Fe(III)分離の利点を提供し、酸化還元バランスを妨げるか、または検体の固着を引き起こす可能性のある静止相なしで動作します。CEは、検出器として誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)と組み合わせることで、検出感度と選択性をさらに向上させます。提示された方法は、バックグラウンド電解質として20 mM HClを使用し、+25 kVの電圧を使用します。ピーク形状と濃度検出限界は、導電率-pHスタッキングによって改善される。56[ArO]+の還元+のために、ICP-MSは反応ガスとしてNH3で動的反応セル(DRC)モードで動作させた。 56この方法は、3 μg/Lの検出(LOD)の限界を達成し、積層のために、分離を妨げることなく、LODを改善することなく、より高い注入量が可能であった。ピーク面積に関するキャリブレーションは、最大150μg/Lのリニアで、測定精度は2.2%(Fe(III))~3.5%(Fe(II))であった。移動時間精度は両方の種について<3%であり、ヒト神経芽細胞腫(SH-SY5Y)細胞の1:2希釈ライセートで決定された。標準添加による回収実験では、97%のFe(III)と105%のFe(II)の精度が明らかになりました。CSFのような実際のバイオサンプルでは、移動時間は様々な導電率(すなわち、生理性)によって変化する可能性があります。これにより、ピーク識別は標準添加により確認される。
今日では、鉄媒介酸化ストレス(OS)が、アルツハイマー病やパーキンソン病、癌,1、2、3、42などの神経変性脳障害において特に複数の疾患において重要な役割3を4果たすことが最も1明らかである。OSはレドックス・カップルのFe(II)/Fe(III)の状態とバランスと密接に関連しています。Fe(III)は酸化還元不活性である一方、Fe(II)は、ヒドロキシルラジカル産生および膜脂質過酸化反応から続く5,H2O2分解を触媒することによって強力に活性酸素種(ROS)を生成する。2分子レベルでは、Fe(II)生成ROSおよびペルオキシドリン脂質は、タンパク質、脂質およびDNA7、8,8の完全性に対する強力な攻撃である。このような有害な細胞機能障害は、ATP含有量9の低下を伴うミトコンドリア機能不全を誘導し、フェロプトシス(FPT)10,11として知られるプログラムされた壊死10,11細胞死を引き起こすことさえできることが実証された。従って、定量的Fe(II)/(III)酸化還元種分化は、広い範囲の酸化還元関連疾患において重要である。
化学種分化は、一般的に生物学的役割および代謝の微量元素の研究のための確立されたツールであり、一般的な77、88だけでなく、神経変性状態12、13、14、15、16、17で。12,13,14,15,16,17文献に含まれるFe-Redox種分化法は、典型的には液体クロマトグラフィー(LC)分離に基づく。文献の一部は、誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)を要素選択的検出器として使用している。ただし、通常の LC 作業では、実行の間に過度のパージ時間が必要でした。さらに問題となるのは、LC カラムのバッチ間の変動により、各カラム変更後に溶出条件の再最適化を余儀なくされた。これらの問題は、ハイスループットを妨げている。許容できる信頼性を得るためには、さらに時間が必要であり、メソッドを再び徹底的に評価します。
これらの欠点を回避するために、毛細血管電気泳動誘導結合プラズマ質量分析法(CE-ICP-MS)に基づくFe(II)/Fe(III)酸化還元法の方法をここで提示します。CEはLC18と比較して様々な利点を提供しています。毛細血管には定常段階がないため、バッチ ID に依存しません(ほぼ)。エージまたはブロックされると、それらはすぐに置き換えられ、通常は変更されないパフォーマンスを示します。サンプル間のパージとクリーニングのステップは効果的で短く、サンプルごとの分析時間も短いです。
提示された方法は、メリットの良い数字と信頼性があります。原理の証明として、この方法はヒトドーパミン作動性神経芽細胞腫(SH-SY5Y)細胞リセートに適用され、癌研究19と同様に神経変性において重要なサンプルタイプである。
鉄はOSの進行において顕著な役割を果たすため、ミトコンドリア機能障害やFTPを促進するため、Ce-ICP-MSベースの同時Fe(II)/Fe(III)の種分化法が本稿で紹介され、その応用は細胞のライゼで例示されています。この方法は、短い分析時間とメリットの数値(LOQ、精度、回復)は、特に神経変性および癌研究において鉄酸化還元種化に関連するサンプルに適しています。LCに基づく以前の方法と比較して、このCEベースの方法は、カラムバッチとLCカラム変更後に以前に観察された再現性の問題から実質的に独立しています。各実行前のキャピラリー調製は<4分で、サンプルあたりの分析時間は3分まで適度な食分です。CZEの移動時間は、分子の電荷とサイズとは別に、サンプルプラグの導電率に依存し、サンプル自体が伝導率に大きく影響する場合に移動時間の変動やシフトを引き起こします。このような移行時間の変化は、毛細管電気泳動においてよく知られている。これはCZE-immanentの問題であり、文献21、22,22から知られている。標準およびSH-SY5Y細胞ライセートは、中程度で均質な導電性を有していた。その結果、移行時間は、精度の高い変更しか示さなかった。しかし、高い導電性を有するサンプルの場合、長時間の移動時間は最大5分観察される可能性がある。したがって、明確な種の識別には標準の追加が推奨されます。
鉄酸化還元の種分化における重要な問題は、サンプル調製88,13の間の種の安定性(すなわち、Fe(II)/(III)平衡の維持)である。不適切なpHやキレート性の化学物質、サンプルに接触する酸素(空気)や深い冷凍貯蔵の中断などの不適切な貯蔵条件は、Fe(II)/(III)バランスを容易に変更することができます。そこで、SH-SY5Y細胞ライセートの調製のために、キレート剤を一切含まないリシス緩衝液を選択し、生理学的pH、サンプル調製中の不活性ガスオーバーレイ、サンプル容器内および即時深凍結でこれらのサンプルに適用した。
文献では、Fe(II)を監視する半定量的アプローチを見つけることができます。酸化ストレスにおける鉄の役割を理解しやすくするために、いくつかの研究グループは、Fe(II)特異的プローブを開発し、鉄鉄の異常な上昇を半定量的に監視し、可視化しました。ただし、重要なのは、このようなプローブは Fe(III) を考慮せず、定量化せず、単に “もっと” または “より少ない” Fe(II)を報告します。現在までに、少数のバイオマーカーのみが、OSとFPTを決定するために利用可能であり、同時にFe(II)/Fe(III)レドックス種23、24,24を定量する信頼性の高い方法の欠如のためである。これを念頭に置いて、提示された方法は、Fe(III)とFe(II)の両方を1回の実行で迅速に定量化することを促進するものであり、鉄依存分子プロセスに関する洞察を深める有望なツールになるかもしれない。
The authors have nothing to disclose.
VVは、ゲッティンゲン大学医療センターの壁内研究助成金(フォルシュングスフェルデルン)とエルゼ・クレナー・フレゼニウス・スティフトゥンのエルゼ・クレナー研究プログラムによって支えられた。
CE capillary | CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany | 105180-25 | |
CE system | PrinCe technolgies | 0005.263 | model PrinCe 760 |
Conical Superclear Tubes 15 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777704 | |
Conical Superclear Tubes 50 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777694 | |
FeCl2 * 4H2O | Merck | 103861 | |
FeCl3 | Merck | 803945 | |
Fluidflex Silikon HG-Schlauch | ProLiquid | 4001106HG | |
Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm | Chromatographie Service GmbH | 105180-25 | |
hydrochloric acid, 1 M | Merck | 1101652500 | corrosive |
ICP-MS | Perkin Elmer | N814003 | |
Luer, 3-way female | BioRad | 7318229 | |
Luer, cone male | neoLab Migge | 2-1895 | |
Luer, male | neoLab Migge | 2-1880 | |
Peakfit peak evaluation software | Systat | PeakFit 4.12 | |
Pt-wire | Carl Roth | 0737.1 | |
PVC tube | ProLiquid | 6000002 | |
RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % | Merck | 814748 | corrosive |
TYGON-tube R-3607 | ProLiquid | 3700203A |