שיטות מתוקננת למדידת אינדוקציה של תגובת הלם חום באלבורבדיוטיס

1. אחזקה וסנכרון של ס. אלאנים לשמור על תולעים ב 20 ° c על הצמיחה Nematode בינונית (NGM) צלחות שנזרע עם OP50 es, חיידק קולי באמצעות העברת מספר מבוגרים לצלחות טריות כ 2x לשבוע10. הטיפול צריך להילקח כדי למנוע מתולעים מפני האוכל, כי זה יכול להשפיע על הפיזיולוגיה שלהם11. הכנת צלחות NGM. מערבבים 3 גרם של הנאל, 2.5 גרם של בקטו-פטון, 20 גרם של אגר, ו מושלו (DI) H2O עד 1 L בבקבוקון. החיטוי התערובת עבור עיקור. אפשר לתערובת להתקרר עד ~ 50 ° c. הוסף 25 מ ל של 1 M KH2פו4 (pH = 6), 1 מ ל של 1 m cacl2, 1 מ ל של 1 m mgso4, ו 1 מ ל של כולסטרול (5 מ”ג/mL ב 100% אתנול). באמצעות טכניקה סטרילית, יוצקים את התערובת לתוך 6 לוחות ס”מ כדי להניב כ 100 צלחות. מזיגת צלחות קלה יותר אם התערובת מועברת לראשונה לגביע סטרילי של 300 מ ל. אפשר יום אחד לגבש בטמפרטורת החדר (RT) לפני זריעה עם חיידקים או לאחסן ב 4 ° c. זריעת חיידקים OP50 על צלחות NGM. לגדל תרבות OP50 בקטריאלי לילה רווי ליברות ב 30 ° צ’ או 37 ° c. מקום כ 300 μL של התרבות על המרכז של לוחית 6 ס”מ NGM. בואו לוחות יבשים ב-RT עבור 1-3 ימים לפי הצורך עבור הדשא החיידקי לדבוק לצלחת. לאחר מכן ניתן להשתמש בלוחות או לאחסנו ב-4 ° c. לגדל את התולעים באופן סינכרוני על ידי בידוד ביצים שהונחו טרי (מתוארים כאן) או לחילופין על ידי איסוף ביצים לאחר המסת תולעים עם אקונומיקה. להעביר כ 10 gravid למבוגרים תולעים לצלחת טרייה באמצעות תיל פלטינה לבחור. סנכרון ביצה עובד הכי טוב אם המבוגרים הם ביום הראשון של הבגרות. לאחר כ 1 h, להסיר את התולעים מן הצלחת. זה צריך לגרום 40-60 ביצים לכל צלחת, בהתאם לתנאים ואת המתח. 2. הדמיה פלואורסצנטית של כתבים HSR לסנכרן את התולעים (סעיף 1.2) ולשמור על 20 ° צ’ עד לשלב ההתפתחותי הרצוי. עבור AM446 (hsp-70p:: gfp) ו CL2070 (hsp-16.2 p:: gfp) מזנים כתבת פלורסנט, תולעים צעירות למבוגרים שעדיין לא הגיעו לבגרות הרבייה נוצרות 64 h לאחר הסינכרון ביצה הנחת.הערה: העיתוי ההתפתחותי משתנה עם כל מאמץ והטמפרטורה בה מורמות התולעים. הזנים של כתבת HSR מציגים עיכוב התפתחותי קל יחסית N2. וחשוב מכך, היקף האינדוקציה של HSR מסרב כ-2-4x לאחר תחילת בגרות הרבייה (ראה דיון). החום מזעזע את התולעים על ידי עטיפת צלחות עם סרט פרפין ומיזוג באמבט מים מחזורי ב-33 ° c לשעה. רצועה דקה של סרט פרפין צריך להיות עטוף 2x סביב הצלחת לאטום את הקצוות. אין לכסות את קרקעית הצלחת או להפריע להעברת החום. הפוך את הלוחות הפוכים באמצעות מתלה לבדיקה ומשקל עופרת. זכור לכלול דגימת שליטה שלילית (ללא הלם חום) במידת הצורך.הערה: אם סרט הפרפין אינו בטוח, אז המים ייכנסו לצלחת ואין להשתמש בצלחת לאיסוף נתונים. לשחזר את התולעים על ידי הסרת לוחיות מתוך אמבט מים וייבוש עם מגבת נייר. להסיר את הסרט פרפין ו מודתיאת התולעים ב 20 ° c עבור 6-24 h. תקופת ההחלמה הזו מאפשרת זמן מספיק עבור סינתזה GFP וקיפול לפני הדמיה. הכן שקופיות לדימות. יש להכין שקופיות טריות לכל שימוש. להפוך את הפתרון 3% התעורר מים וחום באמצעות מיקרוגל עד התפרקה הוא הומס. מניחים שקופית מיקרוסקופ עבור הדמיה בין שני שקופיות מיקרוסקופ אחרים כי יש רצועה של קלטת מעבדה עליהם כדי ליצור מרווח עבור כרית agarose. באמצעות הפיפטה 1,000 μL, מניחים טיפה (~ 150 μL) של הצמח 3% מחומם במרכז שקופית המיקרוסקופ. מיד לכסות את שקופית המיקרוסקופ עם שקופית מיקרוסקופ ריק בניצב לשקופית הראשונה, כך השקופית העליונה נשענת על קלטת המעבדה על השקופיות הסמוכות. זה מתפשט את הירידה של agarose כדי ליצור משטח של רוחב אחיד. הסר בזהירות את השקופית העליונה. השתק את התולעים באמצעות מ200 μL הצינורות כדי להוסיף טיפה קטנה (~ 5 μL) של 1 מילימטר levamisole ב M9 מאגר למרכז של כרית agarose. ואז להעביר 10 תולעים לתוך הירידה של levamisole באמצעות תיל פלטינה לבחור. . כיסוי עם שמיכות איטום הכיסויים אינו הכרחי עבור מיקרוסקופ זקוף. באופן אופציונלי, התולעים ניתן ליישר כאשר הם נעשים משותק על ידי הפצת levamisole כבוי, מחוץ לשטח הצמח, וליישר את התולעים עם בוחר חוט פלטינה. לחלופין, ניתן לטבול את levamisole באמצעות ניגוב מעבדה.הערה: התמונה מוקדם ככל האפשר, כי דגירה ממושכת ב levamisole יכול לשנות את הזריחה. תמונה של תולעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית. הפרטים של לכידת תמונה משתנים על ידי מיקרוסקופ ותוכנה.הערה: כדי להשוות באופן ישיר את עוצמות התמונה, השתמש בהגדרות מיקרוסקופ זהות בהפעלת הדמיה אחת. הימנע מלכייל את התמונה. 3. מדידה של ביטוי גנים HSR באמצעות RT-qPCR לסנכרן תולעים (סעיף 1.2) ולשמור על 20 ° c עד לשלב ההתפתחותי הרצוי. עבור תולעים N2, תולעים צעירות למבוגרים שעדיין לא הגיעו לבגרות הרבייה נוצרות 60 h לאחר הסינכרון ביצת הטלת.הערה: העיתוי ההתפתחותי משתנה עם כל מאמץ והטמפרטורה בה מורמות התולעים. וחשוב מכך, היקף האינדוקציה של HSR מסרב כ-2-4x לאחר תחילת בגרות הרבייה (ראה דיון). תולעי הלם מהחום כמתואר בשלב 2.2. קחו את הצלחות מתוך אמבט מים, להסיר את הסרט פרפין, ומיד לאסוף את התולעים. תולעים ניתן לאסוף על ידי שטיפת צלחות בעדינות עם 1 mL של M9, איסוף הנוזל בצינור מיקרוצנטריפוגה, ולאחר מכן הסרת M9 לאחר צנטריפוגה ב 400 x g עבור 1 דקות. ליאוס את התולעים ולטהר את ה-RNA באמצעות חילוץ אורגני. הוסף 250 μL של מגיב בידוד RNA (ראה טבלת חומרים). מערבולת צינורות ביד עבור 30 s. צינורות וורטקס למשך 20 דקות ב -4 ° צ’ באמצעות אביזר שפופרת מיקרוצנטריפוגה (ראו טבלת חומרים). הוסף 50 μL של כלורופורם. . מערבולת ל -30 מנות מודקון את הדגימות ב RT עבור 3 דקות. צנטריפוגה ב ≥ 14,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c. העבר את השכבה הימית (כלומר, השכבה העליונה, ~ 125 μL) לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.הערה: הימנע מהשכבה האורגנית ומהחומר שבממשק. הוסף 50 μL של כלורופורם. . מערבולת ל -30 מנות מודקון את הדגימות ב RT עבור 3 דקות. צנטריפוגה ב ≥ 14,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. העבר את השכבה הימית (~ 100 μL) לשפופרת מיקרוצנטריפוגה חדשה.הערה: הימנע מהשכבה האורגנית ומהחומר שבממשק. מזרז RNA עם כרך שווה (כלומר, 100 μL) של איזופנול. המלון ממוקם ב-20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות, אבל עדיף בלילה.הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן, וניתן לאחסן את ה-RNA ב-20 ° c. גלולה RNA על ידי צנטריפוגה ב ≥ 14,000 x g עבור ≥ 30 דקות ב 4 ° c. הסירו ככל האפשר את הסופרנטנט. מבלי להפריע לגלולההערה: הגלולה תהיה קטנה וייתכן שלא תהיה גלויה. הגלולה לא יכול לדבוק היטב בצד של הצינור, כך זהירות היא הכרחית כדי להימנע מלנופש אותו. לשטוף את הגלולה עם 250 μL של 70% קרח קר אתנול עשה עם RNase-H חינם2O. צנטריפוגה ב ≥ 14,000 x g עבור ≥ 5 דקות ב 4 ° c. הסר כמות גדולה ככל האפשר. מבלי להפריע לגלולה לבצע ספין מהיר ב RT כדי להסיר את כל השאר 70% אתנול. יבש את הגלולה על ידי עזיבת הצינורות לפתוח ב RT כל עוד יש צורך; בדרך כלל לפחות 20 דקות. צינורות יכולים להיות מכוסים בנייר טואלט נטול סיבים או אלומיניום כדי למנוע זיהום. השהה מחדש את הגלולה ב 20 μL של RNase-H חינם2O. לקבוע את הריכוז RNA באמצעות כמות קטנה ספקטרוסקופיה (2 μL).הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן, וניתן לאחסן את RNA באופן זמני ב-20 ° c או מתחתיו. הסר דנ א שיורית על ידי הדגירה עם DNase I. מומלץ להשתמש בערכה הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) ולבצע את הוראות היצרן. עם ערכה זו, להכין את התגובה 20 μL עם 500 ng של RNA ו 1 μL של DNase I באמבט מים 37 ° c עבור 30 דקות. להוסיף 2.5 μL של הפעלה מגיב DNase (כלול בערכה) לכל דגם ו-מודטה ב RT עבור 5 דקות עם מזדמן/וורטקנג. ספין למטה ב 14,000 x g עבור 2 דקות. מבלי להפריע את הגלולה הלבנה, העבר 15 μL של סופרנטאנט למיקרוצינורית טרייה לסינתזה של cDNA. . התנהלות בסינתזה של דנ א מומלץ להשתמש בערכה הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) ולבצע את הוראות היצרן. עם הערכה, להכין את התגובה 20 μL עם 15 μL של DNase I-שטופלו RNA מן השלב הקודם 1 μL של היפוך הטרנסקריפטאז. השתמש בתוכנית הבאה לסינתזה של cDNA: 25 ° c עבור 5 דקות, 46 ° c עבור 20 דקות, 95 ° c עבור 1 דקות, 4 ° c להחזיק. לדלל cDNA על ידי הוספת 80 μL של RNase-H חינם2O ישירות למדגם. מערבולת קצרה, ואז להסתובב ולאחסן ב-20 ° c עד הצורך. לבצע qPCR. מומלץ להשתמש בערכה הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) ולבצע את הוראות היצרן. עם הערכה, להכין את התגובה 25 μL המכיל 2 μL של cDNA ו 200 ננומטר (כל אחד) של קדימה והפוך התחל באחד היטב של צלחת 96-באר. פריימר רצפים למדידת גנים זעזועים חום, hsp-70 ו -hsp-16.2, ו -18s rrna (עבור בקרת נורמליזציה) מפורטים בטבלת החומרים. ניתן להשתמש בבקרי נורמליזציה מרובים כרצונכם. לדלל cDNA דגימות 50x לפני מדידה של 18S כדי להבטיח את השיטת הוא בטווח הליניארי. תנאי ה-qPCR המתאימים משתנים בהתאם לערכת השימוש והתחל (ראה תוצאות מייצגות). השתמש במערכת זיהוי PCR בזמן אמת (ראה טבלת חומרים) עבור qpcr עם 40 מחזורים של 95 ° צ’ עבור 5 s הדנטורציה, 58 ° צ’ עבור 30 s ריפוי, ו 72 ° c עבור 30 הארכה.הערה: טמפרטורת ריפוי אופטימלית יכולה להשתנות באמצעות התחל והתנאים. ככמת באמצעות שיטת העקומה ΔΔCt או הרגילה12. 4. שיטת המדידה הגבוהה ביותר למדידת HSR ברמה ארגונית לסנכרן את התולעים (סעיף 1.2) ולשמור על 20 ° צ’ עד לשלב ההתפתחותי הרצוי. עבור תולעים N2, תולעים צעירות למבוגרים שעדיין לא הגיעו לבגרות הרבייה נוצרות 60 h לאחר הסינכרון ביצת הטלת.הערה: העיתוי ההתפתחותי משתנה עם כל מאמץ והטמפרטורה בה מורמות התולעים. וחשוב מכך, היקף האינדוקציה של HSR מסרב כ-2-4x לאחר תחילת בגרות הרבייה (ראה דיון). החום מזעזע את התולעים כמתואר בשלב 2.2 עבור 6 h. הסר את לוחיות מאמבט מים, להסיר את הסרט פרפין, ולאפשר לתולעים להתאושש על ידי דגירה ב 20 ° c עבור 48 h. לספור את מספר התולעים שיכול מיד לזחול משם לאחר גירוי מכני ללא תנועה או שיתוק מיובש.הערה: הדגירה של 6 שעות היא אופטימלית לבדיקת התנאים הפחתת מאוד שעות החשיפה, אך ייתכן שיהיה צורך לחפש תנאים המשפרים מאוד את המצב התרמי.