Ensaio de amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP) para a detecção específica e rápida do vírus do lago tilápia

A doença do vírus do lago tilápia (TiLVD) é uma doença viral na tilápia (Oreochromis spp.) que supostamente causa mortes por tilápia em muitas regiões do mundo, incluindo Ásia^1,2, África e América. A doença foi reconhecida pela primeira vez durante a mortalidade em massa da tilápia em 2009 em Israel, onde o número de tilápiasilvestre no Lago Kinneret despencou drasticamente de 257 para 8 toneladas por ano². A doença é causada pelo vírus do lago tilápia (TiLV), que foi atribuído à família Amnoonviridae como um novo gênero tilápide e uma nova espécie tilápide tilápide³. A caracterização genética do TiLV mostrou que o vírus é um novo vírus RNA de sentido negativo, de sentido único, que tem 10 segmentos codificando 10 proteínas^1,2,4. Várias espécies de tilápia do gênero Sarotherodon, Oreochromis, tilapine e outros peixes de água quente (por exemplo, gourami gigante(Osphronemus goramy))mostraram-se suscetíveis ao TiLV^2,5. Atualmente, esse vírus continua a se espalhar globalmente, possivelmente através do movimento de peixes vivos infectados^6,7, enquanto o risco de transmissão viral através de tilápia congelada ou seu produto é limitado⁸. A mortalidade substancial por infecção por TiLV tem o potencial de ter um impacto econômico significativamente prejudicial na indústria da tilápia. Por exemplo, o impacto econômico da síndrome da mortalidade no verão no Egito associado à infecção por TiLV foi calculado em US$ 100 milhões⁹. Nesse meio tempo, é importante desenvolver um método de diagnóstico rápido e adequado para facilitar o controle dessa doença nas fazendas de peixes.

Até agora, o diagnóstico de TiLVD foi baseado em ensaios moleculares, isolamento viral e histopatologia. Diferentes protocolos de PCR e primers foram desenvolvidos para o diagnóstico tilv^10,11. Por exemplo, um método de PCR quantitativo de transcrição reversa baseado em verde SYBR (RT-qPCR) com sensibilidade para detectar apenas duas cópias/μL do vírus foi desenvolvido e validado para detecção de TiLV¹⁰. Outros métodos de PCR para detecção de TiLV incluem o PCR quantitativo TaqMan^11,RT-PCR^2,o NS-PCR¹²aninhado e o RT-PCR¹³semi-aninhado . No entanto, esses métodos requerem equipamentos de laboratório sofisticados e períodos relativamente longos de tempo para produzir resultados devido à complexidade das reações, o que os torna inadequados para a aplicação em campo.

O ensaio de amplificação isotérmica (LAMP) mediado por loop é uma aplicação rápida, simples e prática para o campo^14,15. A técnica emprega o princípio de uma reação de deslocamento de fios, enquanto a reação de amplificação corre sob condições isotérmicas sem um ciclo térmico sofisticado e caro^14,15. Consequentemente, produtos LAMP amplificados ou produtos RT-LAMP são analisados em bandas semelhantes a escadas usando eletroforese de gel de agarose com uma mancha fluorescente para visualização segura de DNA ou RNA¹⁴ ou observação a olho nu para a presença de turbidez ou um precipitado branco^16,17,18. Por essas razões, esta técnica tem sido utilizada para a detecção in loco de diferentes patógenos de peixes^{17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27}. O objetivo deste estudo foi estabelecer um ensaio RT-LAMP rápido, sensível e preciso para detecção de TiLV. O ensaio RT-LAMP oferece triagem para TiLV em amostras de peixes dentro de 30 min. A técnica pode ser aplicada para o diagnóstico e vigilância do TiLVD.