Reverse Transcription Loop-Bemiddelde Isothermale Versterking (RT-LAMP) Assay voor de specifieke en snelle detectie van Tilapia Lake Virus
Summary
We presenteren een RT-LAMP test voor de detectie van TiLV in tilapia vissen met behulp van eenvoudige instrumenten over een relatief korte periode van tijd in vergelijking met conventionele RT-PCR technieken. Dit protocol kan helpen bij de bestrijding van de epidemische verspreiding van TiLVD, vooral in ontwikkelingslanden.
Abstract
Tilapia lake virus disease (TiLVD), een opkomende virale ziekte in tilapia veroorzaakt door het tilapia meer virus (TiLV), is een aanhoudende uitdaging in de aquacultuur-industrie die heeft geresulteerd in de massale morbiditeit en mortaliteit van tilapia in vele delen van de wereld. Een effectieve, snelle en nauwkeurige diagnostische test voor TiLV-infectie is daarom noodzakelijk om de eerste infectie op te sporen en de verspreiding van de ziekte in de aquacultuurlandbouw te voorkomen. In deze studie wordt een zeer gevoelige en praktische reverse transcription loop-gemedieerde isothermale versterking (RT-LAMP) methode gepresenteerd om tilapia lake virus in visweefsel op te sporen. Een vergelijking van de RT-qPCR en RT-LAMP testen van geïnfecteerde monsters bleek positieve resultaten in 63 (100%) en 51 (80,95%) respectievelijk monsters. Bovendien bleek uit een analyse van niet-geïnfecteerde monsters dat alle 63 niet-geïnfecteerde weefsels negatieve resultaten opleverden voor zowel de RT-qPCR als de RT-LAMP-test. De kruisreactiviteit met vijf ziekteverwekkers in tilapia werd geëvalueerd met behulp van RT-LAMP, en alle tests toonden negatieve resultaten. Zowel de lever en slijm monsters verkregen van besmette vissen toonde vergelijkbare resultaten met behulp van de RT-LAMP methode, wat suggereert dat slijm kan worden gebruikt in RT-LAMP als een niet-dodelijke test om te voorkomen dat het doden van vis. Tot slot toonden de resultaten aan dat de gepresenteerde RT-LAMP-test een effectieve methode biedt voor TiLV-detectie in tilapiaweefsel binnen 1 uur. De methode wordt daarom aanbevolen als een screening instrument op boerderijen voor de snelle diagnose van TiLV.
Introduction
Tilapia lake virus disease (TiLVD) is een virale ziekte in tilapia(Oreochromis spp.) die naar verluidt tilapia sterfgevallen veroorzaakt in veel regio’s van de wereld, waaronder Azië1,,2, Afrika en Amerika. De ziekte werd voor het eerst erkend tijdens de massale sterfte van tilapia in 2009 in Israël, waar het aantal wilde tilapia in het Kinneretmeer drastisch kelderde van 257 tot 8 ton per jaar2. De ziekte wordt veroorzaakt door het tilapiameervirus (TiLV), dat aan de familie Amnoonviridae is toegewezen als een nieuw geslacht Tilapinevirus en een nieuwe soort Tilapia tilapinevirus3. Genetische karakterisering van TiLV toonde aan dat het virus is een nieuwe omhuld, negatief-zin, single-stranded RNA virus dat 10 segmenten codering 10 eiwitten1,2,4. Verschillende soorten tilapia in het geslacht Sarotherodon, Oreochromis, en Tilapine en andere warmwatervissen (bijvoorbeeld reuzengourami (Osphronemus goramie))zijn vatbaar gebleken voor TiLV2,5. Momenteel blijft dit virus zich wereldwijd verspreiden, mogelijk door de beweging van besmette levende vissen6,7, terwijl het risico van virale overdracht via bevroren tilapia of het product ervan beperkt is8. Aanzienlijke sterfte als gevolg van TiLV-infectie heeft het potentieel om een aanzienlijk schadelijk economisch effect op de tilapia-industrie hebben. Bijvoorbeeld, de economische impact van de zomer sterfte syndroom in Egypte in verband met TiLV infectie werd berekend op US $ 100 miljoen9. Daarom is het belangrijk om een snelle en goede diagnostische methode te ontwikkelen om de bestrijding van deze ziekte in viskwekerijen te vergemakkelijken.
Tot nu toe was de diagnose van TiLVD gebaseerd op moleculaire testen, virale isolatie en histopathologie. Voor TiLV diagnose10,11zijn verschillende PCR protocollen en primers ontwikkeld. Bijvoorbeeld, een SYBR groen-gebaseerde reverse transcription kwantitatieve PCR (RT-qPCR) methode met de gevoeligheid voor het detecteren van zo weinig als twee kopieën / μL van het virus is ontwikkeld en gevalideerd voor TiLV detectie10. Andere PCR-methoden voor TiLV-detectie zijn TaqMan quantitative PCR11,RT-PCR2,geneste RT-PCR12en semi-geneste RT-PCR13. Deze methoden vereisen echter geavanceerde laboratoriumapparatuur en relatief langere perioden om resultaten op te leveren vanwege de complexiteit van de reacties, waardoor ze ongeschikt zijn voor veldtoepassing.
De lus-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) test is een snelle, eenvoudige en praktische for-field toepassing14,15. De techniek maakt gebruik van het principe van een bundelverplaatsingsreactie, terwijl de versterkingsreactie onder isothermale omstandigheden loopt zonder een geavanceerde en dure thermische cycler14,15. Bijgevolg worden versterkte LAMP-producten of RT-LAMP-producten geanalyseerd in ladderachtige banden met behulp van agarosegelelektroforese met een fluorescerende vlek voor ofwel de veilige visualisatie van DNA of RNA14 of observatie met het blote oog voor de aanwezigheid van troebelheid of een witteneerslaan16,17,18. Om deze redenen is deze techniek gebruikt voor de detectie ter plaatse van verschillende vispathogenen17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Het doel van deze studie was om een snelle, gevoelige en nauwkeurige RT-LAMP test voor TiLV detectie vast te stellen. De RT-LAMP test biedt screening voor TiLV in vismonsters binnen 30 min. De techniek kan worden toegepast voor de diagnose en bewaking van TiLVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
De aquacultuursector wordt voortdurend bedreigd door virale infecties die aanzienlijke economische verliezen veroorzaken9,23,28. Zo vormt de opkomende TiLV een grote bedreiging voor de landen die zich in vele delen van dewereld1,6,9. Tot nu toe zijn er geen specifieke therapieën beschikbaar om TiLVD te voorkomen. Terwijl de ontwikkelin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het project wordt financieel gefinancierd door Thailand Research Fund (TRF) subsidienummer RDG6050078 en het Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand onder de Higher Education Research Promotion en National Research University Project van Thailand, Office of the Higher Education Commission, Ministerie van Onderwijs, Thailand. Het onderzoek wordt mede ondersteund door de Graduate Program Scholarship van de Graduate School, Kasetsart University. De auteurs willen Dr. Kwanrawee Sirikanchana bedanken voor het verhaal dat over de video spreekt en Piyawatchara Sikarin voor het bewerken van de video.
Materials
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| – Direct-zol RNA PreWash | |||
| – RNA Wash Buffer | |||
| – DNase/RNase-free water | |||
| – Zymo-spin IIICG columns | |||
| – Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| – Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| – Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| – Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
References
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
- Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
- Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
- Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
- Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , (2017).
- Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
- Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
- Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality’ syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
- Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
- Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
- Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
- Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
- Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
- Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
- Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
- Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
- Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
- Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Biologie du développement. 121, 255-261 (2005).
- Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
- Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
- Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
- Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
- Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).
