미세 유체 챔버 시스템을 사용하여 모터 뉴런 배양에서 세포기관의 축축한 수송
Summary
축색 수송은 운동 신경 건강을 위한 중요한 기계장치입니다. 이 프로토콜에서 우리는 미세 유체 챔버를 사용하여 운동 뉴런 축축에서 산성 구획및 미토콘드리아의 축산 수송을 추적하기위한 상세한 방법을 제공합니다.
Abstract
운동 뉴런 (MN)은 매우 긴 축축을 가진 고도로 편광된 세포입니다. 축 색 수송은 MN 건강에 대 한 중요 한 메커니즘, 신경 성장에 기여, 개발, 그리고 생존. 우리는 MN 축색에 형광 표지된 소기관의 축색 수송을 추적하기 위한 미세 유체 챔버 (MFC)의 사용을 위한 상세한 방법을 기술합니다. 이 방법은 빠르고 비교적 저렴하며 공간과 시간에서 세포내 큐를 모니터링할 수 있습니다. 우리는 단계별 프로토콜을 설명한다: 1) 폴리디메틸실록산(PDMS) MFC의 제조; 2) MFC에서 복부 척수 이식 및 MN 해리 배양의 도금; 3) 미토콘드리아 및 산성 구획의 라벨링 과 라이브 공초점 상상력; 4) 수동 및 반자동 축색 수송 분석. 마지막으로, 우리는 HB9::GFP 복부 척수 의 미토콘드리아 및 산성 구획의 수송에 있는 다름을 시스템 타당성의 증거로 축삭을 심출한다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 다양한 축색 부품의 축색 수송을 연구하기 위한 효율적인 도구와 공간 실험 가능성을 발견하는 데 도움이 되는 MFC 사용에 대한 단순화된 설명서를 제공합니다.
Introduction
MN은 성인 인간에서 1 미터 까지 도달하는 긴 축색을 가진 높게 편광한 세포입니다. 이러한 현상은 MN 연결 및 기능 유지 관리에 중요한 과제를 만듭니다. 따라서, MN은 세포체에서 시냅스및 뒤로 축세포를 따라 정보, 세포기관 및 물질의 적절한 수송에 의존합니다. 단백질 RNA 및 세포기관과 같은 다양한 세포 성분은 축색을 통해 정기적으로 셔틀됩니다. 미토콘드리아는 MN에서 일상적으로 수송되는 중요한 세포기관입니다.1,2 미토콘드리아의 축색 수송은 잘 연구 된 과정3,,4. 흥미롭게도, 미토콘드리아 수송에 있는 결점은 몇몇 신경 퇴행성 질병 및 특히 MN질병5에서관련시키기 위하여 보고되었다. 산성 구획은 MN 축색을 따라 움직이는 본질적인 세포기관에 대한 또 다른 예가 됩니다. 산성 구획에는 리소좀, 내인성, 트랜스 골지 장치 및 특정 분비 소포6이포함된다. 산성 구획의 축축한 수송에 있는 결점은 몇몇 신경 퇴행성 질병 에서 뿐만 아니라7에서찾아냈고, 최근 논문은 MN 질병8에서그 중요성을 강조합니다.
축축산 수송을 효율적으로 연구하기 위해, 체세포와 축색 구획을 분리하는 미세 유체 챔버는 자주9,,10을사용한다. 미세 유체 시스템의 두 가지 중요한 장점, 및 구획화 및 축슨의 분리는, 아세포 과정(11)의연구에 이상적 렌더링. 신경 세포 체와 축세포 사이의 공간 분리는 다른 뉴런 구획의 세포 외 환경을 조작하는 데 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 축사 대 소마). 생화학적, 신경 성장/변성 및 면역 형광 분석실험은 모두 이 플랫폼에서 유익합니다. MFC는 또한 골격 근12,,13,,14와같은 다른 세포 유형과 뉴런을 coculturing으로써 세포 간 통신을 연구하는 데 도움을 줄 수 있습니다.
여기에서는 운동 뉴런에서 미토콘드리아 및 산성 구획 수송을 모니터링하기 위한 간단하면서도 정확한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 또한 역행 및 전위 이동 소기관의 상대적 비율뿐만 아니라 수송 속도의 분포를 비교하여이 방법의 사용을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서는 운동 뉴런에서 미토콘드리아 및 산성 구획의 축색 수송을 추적하는 시스템을 설명합니다. 이 단순화된 체외 플랫폼은 세포외 뉴런 구획을 정밀하게 제어, 모니터링 및 조작할 수 있게 해주며, 모터 뉴런 국소 기능을 실험분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 ALS와 같은 MN 질환을 연구하는 데 유용할 수 있으며, 질병10,,16에서축색 수송 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 이스라엘 과학 재단 (ISF, 561/11)과 유럽 연구 위원회 (ERC, 309377)의 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software – version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium – Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
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