النقل المحوري للأرغنفيات في ثقافات الخلايا العصبية الحركية باستخدام نظام غرف السوائل الدقيقة
Summary
النقل المحوري هو آلية حاسمة لصحة الخلايا العصبية الحركية. في هذا البروتوكول نقدم طريقة مفصلة لتتبع النقل المحوري للمقصورات الحمضية والميتوكوندريا في محاور عصبية المحرك باستخدام غرف microfluidic.
Abstract
الخلايا العصبية الحركية (MNs) هي خلايا مستقطبة للغاية مع محاور طويلة جدا. النقل المحوري هو آلية حاسمة لصحة MN، مما يساهم في نمو الخلايا العصبية، والتنمية، والبقاء على قيد الحياة. نحن نصف طريقة مفصلة لاستخدام غرف microfluidic (MFCs) لتتبع النقل المحوري للالعضيات المسماة الفلورسنت في محاور MN. هذه الطريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا، ويسمح لرصد الإشارات داخل الخلايا في المكان والزمان. ونحن نصف بروتوكول خطوة بخطوة لما يلي: 1) تصنيع شركات التمويل الأصغر المتعددة الأبعاد؛ (1) تصنيع المواد متعددة الأبعاد؛ 1 2) طلاء النباتات الخارجية الحبل الشوكي البطني وMN الثقافة المنفصلة في MFCs؛ 3) وضع العلامات من الميتوكوندريا والمقصورات الحمضية تليها حية confocal تخيل; 4) دليل وشبه الآلي تحليل النقل المحوري. وأخيرا، نحن نظهر فرقا في نقل الميتوكوندريا والمقصورات الحمضية من HB9::GFP الحبل الشوكي البطني explant محاور عصبية كدليل على صحة النظام. وإجمالاً، يوفر هذا البروتوكول أداة فعالة لدراسة النقل المحوري لمختلف المكونات المحورية، فضلاً عن دليل مبسط لاستخدام MFC للمساعدة في اكتشاف الإمكانيات التجريبية المكانية.
Introduction
MNs هي خلايا مستقطبة للغاية مع محاور عصبية طويلة ، تصل إلى متر واحد طويل في البشر البالغين. وتخلق هذه الظاهرة تحدياً حاسماً للحفاظ على الاتصال بالشبكة ووظيفتها. وبالتالي، تعتمد MNs على النقل السليم للمعلومات والعضيات والمواد على طول المحاور من جسم الخلية إلى المشبك والظهر. يتم نقل المكونات الخلوية المختلفة ، مثل البروتينات والحمض النووي الريبي والعضيات بانتظام من خلال المحاور. الميتوكوندريا هي العضيات الهامة التي يتم نقلها بشكل روتيني في MNs. الميتوكوندريا ضرورية للنشاط السليم ووظيفة MNs ، المسؤولة عن توفير ATP ، تخزين الكالسيوم ، وعمليات الإشارة1،2. النقل المحوري للالميتوكوندريا هو عملية مدروسة جيدا3,4. ومن المثير للاهتمام، وأفادت عيوب في نقل الميتوكوندريا أن تشارك في العديد من الأمراض العصبية وعلى وجه التحديد في الأمراض MN5. المقصورات الحمضية بمثابة مثال آخر للالعضيات الجوهرية التي تتحرك على طول محاور MN. تشمل المقصورات الحمضية الليسوسوماس والإندوسوماس وجهاز ترانس غولجي وبعض الحويصلات الإفرازية6. تم العثور على عيوب في النقل المحورلل من المقصورات الحمضية في العديد من الأمراض العصبية وكذلك7، والأوراق الأخيرة تسليط الضوء على أهميتها في الأمراض MN8.
لدراسة كفاءة النقل المحوري، وتستخدم غرف microfluidic التي تفصل بين مقصورات جسدية ومحاورية بشكل متكرر9،10. الميزتين الهامتين للنظام microfluidic ، وتجزئة وعزل محاور عصبية ، تجعلها مثالية لدراسة العمليات دون الخلوية11. يمكن استخدام الفصل المكاني بين أجسام الخلايا العصبية والمحاور للتلاعب بالبيئات خارج الخلية لمقصورات الخلايا العصبية المختلفة (على سبيل المثال، محاور عصبية مقابل سوما). البيوكيميائية, نمو الخلايا العصبية / انحطاط, والصفات الفلور المناعي ة جميع الاستفادة من هذا المنبر. MFCs يمكن أن تساعد أيضا في دراسة الاتصالات بين الخلايا والخلايا عن طريق الخلايا العصبية coculturing مع أنواع الخلايا الأخرى, مثل عضلات الهيكل العظمي12,,13,,14.
هنا، ونحن نصف بروتوكول بسيط ولكن دقيقة لرصد الميتوكوندريا ونقل المقصورة الحمضية في الخلايا العصبية الحركية. كما نبين استخدام هذه الطريقة من خلال مقارنة النسبة المئوية النسبية للالعضيات المتحركة الرجعية والسابقة، وكذلك توزيع سرعة النقل.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن نصف نظام لتتبع النقل المحوري للالميتوكوندريا والمقصورات الحمضية في الخلايا العصبية الحركية. يسمح هذا النظام المُبسّط في المختبر بالتحكم الدقيق، والمراقبة، والتلاعب بمقصورات الخلايا العصبية تحت الخلية، مما يتيح إجراء تحليل تجريبي للوظائف المحلية للخلايا العصبي…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF، 561/11) ومجلس البحوث الأوروبي (ERC، 309377).
Materials
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software – version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium – Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
- Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
- Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
- Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
- Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
- Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
- Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
- Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
- Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).
