Rotulagem Balística de Neurônios Piramidais em Fatias Cerebrais e na Cultura Celular Primária
Summary
Apresentamos um protocolo para rotular e analisar neurônios piramidais, o que é fundamental para avaliar possíveis alterações morfológicas em neurônios e espinhas dendríticas que podem estar por trás de anormalidades neuroquímicas e comportamentais.
Abstract
Foi relatado que o tamanho e a forma das espinhas dendríticas estão relacionados com sua plasticidade estrutural. Para identificar a estrutura morfológica de neurônios piramidais e espinhos dendrípticos, uma técnica de rotulagem balística pode ser utilizada. No presente protocolo, os neurônios piramidais são rotulados com tintura DilC18(3) e analisados usando software de reconstrução neuronal para avaliar a morfologia neuronal e as espinhas dendríticas. Para investigar a estrutura neuronal, são realizadas análises de ramificação dendríticas e análise de Sholl, permitindo que os pesquisadores desenhem inferências sobre a complexidade de ramificação dendrítica e a complexidade da árvore neuronal, respectivamente. A avaliação das espinhas dendríticas é realizada utilizando-se um algoritmo de classificação assistida automática integral ao software de reconstrução, que classifica as espinhas em quatro categorias (ou seja, fina, cogumelo, stubby, filopodia). Além disso, três parâmetros adicionais (ou seja, comprimento, diâmetro da cabeça e volume) também são escolhidos para avaliar alterações na morfologia da coluna vertebral dendrítica. Para validar o potencial de ampla aplicação da técnica de rotulagem balística, neurônios piramidais da cultura celular in vitro foram rotulados com sucesso. No geral, o método de rotulagem balística é único e útil para visualizar neurônios em diferentes regiões cerebrais em ratos, o que, em combinação com um sofisticado software de reconstrução, permite aos pesquisadores elucidar os possíveis mecanismos subjacentes disfunção neurocognitiva.
Introduction
Em 2000, Gan et al. descreveram uma técnica de rotulagem rápida para neurônios individuais e glia no sistema nervoso que combinava vários corantes lipofílicos, permitindo a rotulagem simultânea de muitas células cerebrais com cores diferentes1,2. Mais recentemente, uma técnica de rotulagem balística foi descrita por Seabold et al.3 que introduziu corantes fluorescentes (Dil) nos neurônios das fatias cerebrais. Uma técnica versátil de coloração, a rotulagem balística é apreciada por sua capacidade de ser utilizada em múltiplas espécies animais e em uma ampla gama de idades. Além disso, pode ser combinado com imunocoloração para identificar subpopulações de células cerebrais3. Em comparação com as técnicas tradicionais (por exemplo, impregnação de prata golgi-cox, microinjeção)4, a rotulagem balística oferece uma oportunidade para distinguir mais claramente características morfológicas, incluindo colunas dendríticas, característica que é fundamental para desenhar inferências sobre complexidade neuronal e conectividade sináptica5.
Neurônios piramidais excitatórios são caracterizados por um único, grande dendrito apical, múltiplos dendritos basais mais curtos, e milhares de espinhas dendríticas6. Neurônios piramidais são encontrados em múltiplas regiões cerebrais relacionadas ao processamento cognitivo de ordem superior, incluindo o córtex pré-frontal (PFC) e o hipocampo. No PFC, os neurônios piramidais são observados nas camadas II/III e camada V, com cada um apresentando morfologia única. Especificamente, os neurônios piramidais na camada II/III do PFC têm um dendrito apical mais curto e menos ramificação do que os neurônios piramidais na camada V6. Dentro do hipocampo, os neurônios piramidais estão localizados nas regiões CA1 e CA3, com cada uma exibindo morfologias distintas. Especificamente, os neurônios piramidais na região ca1 apresentam um dendrito apical mais distinto, com ramificações ocorrendo mais longe do soma, em relação à região ca36.
Espinhos dendréticos em neurônios piramidais tanto no PFC quanto no hipocampo são o local principal das sinapses excitatórias7. As características morfológicas das espinhas dendríticas, que são classicamente caracterizadas em três categorias primárias (ou seja, finas, stubby ou cogumelo8), foram relacionadas com o tamanho da sinapse excitatória9. Espinhos finos, caracterizados por um pescoço longo e fino, cabeça bulbosa pequena e densidades postynapticas menores, são mais instáveis e desenvolvem conexões mais fracas. No entanto, as espinhas de cogumelos, que têm uma cabeça de coluna dendrítica maior, são reconhecidas por formar conexões sinápticas mais fortes, um efeito resultante de seu tamanho maior. Em contraste acentuado, as espinhas stubby são desprovidas de um pescoço de coluna, exibindo uma razão de volume de cabeça e pescoço aproximadamente igual8. Dentro do hipocampo, espinhos ramificados também podem ser observados, pelo qual a coluna vertebral tem múltiplas cabeças que emergem do mesmo pescoço dendrítico10. Portanto, as mudanças morfológicas das espinhas dendríticas poderiam refletir a funcionalidade e a capacidade estrutural. Além disso, estudos têm demonstrado que o tamanho e a forma das espinhas dendríticas estão relacionados à sua plasticidade estrutural, levando à ideia de que pequenas espinhas estão envolvidas na aprendizagem e na atenção, enquanto espinhas maiores e mais estáveis estão envolvidas em processos de longo prazo, incluindo a memória11. Além disso, a distribuição de espinhos dendréticos ao longo do dendrito pode estar associada à conectividade sináptica5,12.
Assim, o presente trabalho metodológico tem três metas: 1) Apresentar nosso protocolo de rotulagem balística, que tem sido utilizado com uma taxa de sucesso (ou seja, neurônios atendendo aos critérios de seleção e apropriados para análise) de 83,3%5,12,13 e em múltiplas regiões cerebrais (ou seja, PFC, núcleo accumbens, hipocampo); 2) Demonstrar a generalização da técnica e sua aplicação aos neurônios cultivados in vitro; 3) Detalhe a metodologia utilizada no software de reconstrução neuronal e as inferências que podem ser extraídas desses dados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, descrevemos uma técnica de rotulagem versátil para neurônios tanto do cérebro de ratos quanto daqueles cultivados in vitro. Além disso, relatamos a metodologia de utilização do software de reconstrução neuronal e do software de análise quantitativa de reconstrução neuronal para avaliar a morfologia neuronal e as espinhas dendríticas. A avaliação da morfologia neuronal e das espinhas dendríticas fornece uma oportunidade para determinar alterações na complexidade de ramificação dendrít…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelas subvenções do NIH HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624.
Materials
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor “DiOlistic” labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neurosciences. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neurosciences. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
