Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

Im Jahr 2000 beschrieben Gan et al. eine schnelle Etikettierungstechnik für einzelne Neuronen und Glia im Nervensystem, die verschiedene lipophile Farbstoffe kombinierte, was die gleichzeitige Kennzeichnung vieler Gehirnzellen mit verschiedenen Farben^1,2ermöglichte. In jüngerer Zeit wurde eine ballistische Etikettierungstechnik von Seabold et al.³ beschrieben, die fluoreszierende Farbstoffe (Dil) in die Neuronen von Gehirnscheiben einführte. Eine vielseitige Färbetechnik, ballistische Etikettierung wird für seine Fähigkeit geschätzt, in mehreren Tierarten und über eine breite Palette von Altersgruppen verwendet werden. Darüber hinaus kann es mit Immunostainierung kombiniert werden, um Subpopulationen von Gehirnzellen³zu identifizieren. Im Vergleich zu herkömmlichen Techniken (z. B. Golgi-Cox Silberimprägnierung, Mikroinjektion)⁴bietet die ballistische Etikettierung die Möglichkeit, morphologische Merkmale, einschließlich dendritischer Stacheln, klarer zu unterscheiden, ein Merkmal, das entscheidend ist, um Rückschlüsse auf neuronale Komplexität und synaptische Konnektivität zu ziehen⁵.

Exzitatorische pyramidale Neuronen zeichnen sich durch einen einzigen, großen apikalen Dendrit, mehrere kürzere Basaldendriten und Tausende von dendritischen Stacheln⁶aus. Pyramidale Neuronen sind in mehreren Gehirnregionen im Zusammenhang mit höherer Ordnung kognitive Verarbeitung gefunden, einschließlich der präfrontalen Kortex (PFC) und Hippocampus. In der PFC werden pyramidale Neuronen in den Schichten II/III und Schicht V beobachtet, wobei jede eine einzigartige Morphologie aufweist. Insbesondere pyramidenförmige Neuronen in Schicht II/III der PFC haben einen kürzeren apikalen Dendrit und weniger verzweigt als pyramidale Neuronen in Schicht V⁶. Innerhalb des Hippocampus befinden sich pyramidale Neuronen sowohl in den CA1- als auch in der CA3-Region, wobei jede unterschiedliche Morphologie zeigt. Insbesondere pyramidenförmige Neuronen in der CA1-Region weisen einen ausgeprägteren apikalen Dendrit auf, wobei verzweigte Verbindungen weiter vom Soma entfernt auftreten, relativ zur CA3-Region⁶.

Dendritische Stacheln auf pyramidenförmigen Neuronen sowohl im PFC als auch im Hippocampus sind die primäre Stelle für exzitatorische Synapsen⁷. Morphologische Eigenschaften der dendritischen Stacheln, die klassisch in drei primäre Kategorien (d.h. dünn, stumpf oder Pilz⁸) charakterisiert sind, wurden mit der Größe der exzitatorischen Synapse⁹in Verbindung gebracht. Dünne Stacheln, die sich durch einen langen, dünnen Hals, einen kleinen bauchigen Kopf und kleinere postsynaptische Dichten auszeichnen, sind instabiler und entwickeln schwächere Verbindungen. Pilzdornen, die einen größeren dendritischen Wirbelsäulenkopf haben, sind jedoch dafür bekannt, stärkere synaptische Verbindungen zu bilden, ein Effekt, der sich aus ihrer größeren Größe ergibt. Im scharfen Kontrast sind stumpfe Dornen ohne Wirbelsäulenhals, die ein ungefähr gleiches Kopf- und Nackenvolumenverhältnis^{von 8}aufweisen. Innerhalb des Hippocampus können auch verzweigte Stacheln beobachtet werden, wobei die Wirbelsäule mehrere Köpfe hat, die aus dem gleichen dendritischen Wirbelsäulenhals¹⁰hervorgehen. Daher könnten die morphologischen Veränderungen der dendritischen Stacheln Funktionalität und strukturelle Kapazität widerspiegeln. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass die Größe und Form der dendritischen Stacheln mit ihrer strukturellen Plastizität zusammenhängt, was zu der Idee führt, dass kleine Stacheln am Lernen und an der Aufmerksamkeit beteiligt sind, während größere, stabilere Stacheln an langfristigen Prozessen beteiligt sind, einschließlich Gedächtnis¹¹. Darüber hinaus kann die Verteilung der dendritischen Stacheln entlang des Dendriten mit synaptischen Konnektivität^5,12verbunden sein.

So hat das vorliegende methodische Papier drei Ziele: 1) Präsentieren Sie unser Protokoll für die ballistische Kennzeichnung, das mit einer Erfolgsrate (d. h. Neuronen, die Auswahlkriterien erfüllen und für die Analyse geeignet sind) von 83,3%^5,12,13 und über mehrere Hirnregionen hinweg (d. h. PFC, Nucleus accumbens, hippocampus) verwendet wurde. 2) Nachweis der Verallgemeinerbarkeit der Technik und ihrer Anwendung auf in vitro angebaute Neuronen; 3) Erläutern Sie die In-Neuronal-Rekonstruktionssoftware verwendete Methodik und die Schlussfolgerungen, die aus solchen Daten gezogen werden können.