Étiquetage balistique des neurones pyramidaux dans les tranches de cerveau et dans la culture cellulaire primaire
Summary
Nous présentons un protocole pour étiqueter et analyser les neurones pyramidaux, qui est essentiel pour évaluer les altérations morphologiques potentielles dans les neurones et les épines dendritiques qui peuvent sous-tendre les anomalies neurochimiques et comportementales.
Abstract
Il a été rapporté que la taille et la forme des épines dendritiques est liée à leur plasticité structurelle. Pour identifier la structure morphologique des neurones pyramidaux et des épines dendritiques, une technique d’étiquetage balistique peut être utilisée. Dans le protocole actuel, les neurones pyramidaux sont étiquetés avec le colorant DilC18(3) et analysés à l’aide d’un logiciel de reconstruction neuronale pour évaluer la morphologie neuronale et les épines dendritiques. Pour étudier la structure neuronale, l’analyse de branchement dendritique et l’analyse de Sholl sont exécutées, permettant aux chercheurs de tirer des inférences au sujet de la complexité de ramification dendritique et de la complexité neuronale d’arborescence, respectivement. L’évaluation des épines dendritiques est effectuée à l’aide d’un algorithme de classification assisté automatique faisant partie intégrante du logiciel de reconstruction, qui classe les épines en quatre catégories (c.-à-d. minces, champignons, stubby, filopode). De plus, trois autres paramètres (c.-à-d. longueur, diamètre de la tête et volume) sont également choisis pour évaluer les altérations de la morphologie de la colonne vertébrale dendritique. Pour valider le potentiel d’application large de la technique d’étiquetage balistique, les neurones pyramidaux de la culture cellulaire in vitro ont été étiquetés avec succès. Dans l’ensemble, la méthode d’étiquetage balistique est unique et utile pour visualiser les neurones dans différentes régions du cerveau chez les rats, ce qui, en combinaison avec un logiciel de reconstruction sophistiqué, permet aux chercheurs d’élucider les mécanismes possibles sous-jacents dysfonction neurocognitive.
Introduction
En 2000, Gan et coll. ont décrit une technique d’étiquetage rapide pour les neurones individuels et les glia dans le système nerveux qui a combiné divers colorants lipophiles, permettant l’étiquetage simultané de nombreuses cellules du cerveau avec des couleurs différentes1,2. Plus récemment, une technique d’étiquetage balistique a été décrite par Seabold et coll.3 qui a introduit des colorants fluorescents (Dil) dans les neurones des tranches de cerveau. Technique polyvalente de coloration, l’étiquetage balistique est apprécié pour sa capacité à être utilisée chez plusieurs espèces animales et à travers un large éventail d’âges. En outre, il peut être combiné avec l’immunostaining pour identifier les sous-populations des cellules du cerveau3. Par rapport aux techniques traditionnelles (p. ex., l’imprégnation argentée Golgi-Cox, microinjection)4, l’étiquetage balistique offre l’occasion de distinguer plus clairement les caractéristiques morphologiques, y compris les épines dendritiques, une caractéristique essentielle pour tirer des inférences sur la complexité neuronale et la connectivité synaptique5.
Les neurones pyramidaux excitatoires sont caractérisés par un seul, grand dendrite apical, de multiples dendrites basales plus courtes, et des milliers d’épines dendritiques6. Les neurones pyramidaux se trouvent dans plusieurs régions du cerveau liées au traitement cognitif de l’ordre supérieur, y compris le cortex préfrontal (PFC) et l’hippocampe. Dans le PFC, les neurones pyramidaux sont observés dans les couches II/III et la couche V, chacun présentant une morphologie unique. Plus précisément, les neurones pyramidaux dans la couche II/III du PFC ont un dendrite apique plus court et moins de ramification que les neurones pyramidaux dans la couche V6. Dans l’hippocampe, les neurones pyramidaux sont situés dans les régions CA1 et CA3, chacun affichant des morphologies distinctes. Plus précisément, les neurones pyramidaux dans la région de CA1 présentent un dendrite apical plus distinctif, avec la branche se produisant plus loin de la soma, par rapport à la région de CA36.
Les épines dendritiques sur les neurones pyramidaux dans le PFC et l’hippocampe sont le site primaire des synapses excitatrices7. Les caractéristiques morphologiques des épines dendritiques, qui sont classiquement caractérisées en trois catégories primaires (c.-à-d. minces, trapues, ou champignons8), ont été liées à la taille de la synapse excitatrice9. Les épines minces, caractérisées par un long cou mince, une petite tête bulbeuse et de plus petites densités postsynaptiques, sont plus instables et développent des connexions plus faibles. Cependant, les épines de champignon, qui ont une tête de colonne vertébrale dendritique plus grande, sont identifiées pour former des connexions synaptiques plus fortes, un effet résultant de leur plus grande taille. En contraste net, les épines trapues sont dépourvues d’un cou de la colonne vertébrale, présentant un rapport de volume de la tête et du cou à peu près égal8. Dans l’hippocampe, des épines ramifiées peuvent également être observées, auquel cas la colonne vertébrale a plusieurs têtes qui émergent du même cou de la colonne vertébrale dendritique10. Par conséquent, les changements morphologiques des épines dendritiques pourraient refléter la fonctionnalité et la capacité structurelle. En outre, des études ont démontré que la taille et la forme des épines dendritiques se rapportent à leur plasticité structurelle, conduisant à l’idée que les petites épines sont impliquées dans l’apprentissage et l’attention, tandis que de plus grandes épines plus stables, sont impliqués dans des processus à long terme, y compris la mémoire11. En outre, la distribution des épines dendritiques le long de la dendrite peut être associée à la connectivité synaptique5,12.
Ainsi, le présent document méthodologique a trois objectifs: 1) Présenter notre protocole d’étiquetage balistique, qui a été utilisé avec un taux de réussite (c’est-à-dire, neurones répondant aux critères de sélection et approprié pour l’analyse) de 83,3%5,12,13 et à travers les régions du cerveau multiples (c.-à-d., PFC, noyau accumbens, hippocampe); 2) Démontrer la généralisation de la technique et son application aux neurones cultivés in vitro; 3) Détail de la méthodologie utilisée dans le logiciel de reconstruction neuronale et les inférences qui peuvent être tirées à partir de ces données.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons une technique d’étiquetage polyvalente pour les neurones du cerveau de rat et ceux cultivés in vitro. En outre, nous rapportons la méthodologie pour utiliser le logiciel de reconstruction neuronale et le logiciel d’analyse quantitative de reconstruction neuronale pour évaluer la morphologie neuronale et les épines dendritiques. L’évaluation de la morphologie neuronale et des épines dendritiques fournit une occasion de déterminer des altérations dans la complexité de rami…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par les subventions des NIH HD043680, MH106392, DA013137 et NS100624.
Materials
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
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- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
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