Estima-se que mais de 80% das proteínas tenham interações com outras moléculas¹, o que enfatiza a importância dos IPP para a execução de funções biológicas específicas na célula². Algumas proteínas funcionam como hubs facilitando a montagem de complexos maiores que são necessários para a sobrevivência celular¹. Esses hubs mediam vários PPIs e ajudam a organizar proteínas em uma rede que facilita funções específicas em uma célula³. A formação de complexos proteicos também é afetada pelo contexto biológico, como a presença ou ausência de parceiros de interação específicos⁴, eventos de sinalização celular e estágio de desenvolvimento de uma célula.

C. elegans é comumente usado como um organismo modelo para uma variedade de estudos, incluindo o desenvolvimento. A simples anatomia deste animal é composta por vários órgãos, incluindo a gonade, intestino e cutícula transparente, o que facilita a análise do desenvolvimento de vermes. A germinação residente na gônada é uma ótima ferramenta para estudar como as células-tronco germinais amadurecem em gametas⁵ que se desenvolvem em embriões e, eventualmente, na próxima geração de descendentes. A região distal da ponta da germinação contém um pool de células-tronco auto-renovadoras (Figura 1). À medida que as células-tronco saem do nicho, elas avançam para o pacitene meiotico e eventualmente se desenvolvem em oócitos na fase adulta jovem (Figura 1). Este programa de desenvolvimento na germinação é fortemente regulado através de diferentes mecanismos, incluindo uma rede reguladora pós-transcricional facilitada por proteínas de ligação de RNA (RBPs)⁶. Os PPIs são importantes para essa atividade regulatória, pois os RBPs se associam a outros cofatores para exercer suas funções.

Existem várias abordagens que podem ser usadas para sondar ppis no worm, mas cada uma tem limitações únicas. A imunoprecipitação in vivo (IP) pode ser usada para isolar complexos proteína-proteína de extratos inteiros de vermes; no entanto, essa abordagem não indica onde o PPI ocorre no worm. Além disso, complexos proteicos que são transitórios e só se formam durante um estágio específico de desenvolvimento ou em um número limitado de células podem ser difíceis de recuperar por co-imunoprecipitação. Finalmente, os experimentos de IP precisam abordar as preocupações do resortment complexo de proteínas após a lipose e a retenção não específica de proteínas na matriz de afinidade.

Abordagens alternativas para detecção in situ de PPIs são co-imunocoloração, transferência de energia de ressonância Förster (FRET) e complementação de fluorescência bimolecular (BiFC). A co-imunocoloração depende da detecção simultânea de duas proteínas de interesse no tecido de verme fixo e da medição da extensão da colocalização do sinal. O uso da microscopia de superresolução, que oferece maior detalhe do que a microscopia padrão^7,ajuda a testar mais rigorosamente a colocalização de proteínas além da barreira limitada à difração de 200-300 nm⁸. No entanto, a co-imunocoloração usando microscopia convencional e de superresolução funciona melhor para proteínas com padrões de localização bem definidos. Em contraste, torna-se muito menos informativo para parceiros interagindo difundidos. A medição para co-localização de sinais com base na sobreposição não fornece informações precisas sobre se as proteínas estão em complexo entre si^9,10.

Além disso, a co-imunoprecipitação e a co-imunocoloração de complexos proteína-proteína não são quantitativas, tornando desafiador determinar se tais interações são significativas. FRET e BiFC são técnicas baseadas em fluorescentes. Fret baseia-se na marcação de proteínas de interesse com proteínas fluorescentes (FPs) que têm sobreposição espectral na qual a energia de um FP (doador) é transferida para outro FP (aceitador)¹¹. Esta transferência não radiativa de energia resulta em fluorescência do FP aceitador que pode ser detectada em seu respectivo comprimento de onda de emissão. O BiFC baseia-se na reconstituição de uma proteína fluorescente in vivo. Implica a divisão do GFP em dois fragmentos complementares, como helicos 1-10 e hélice 11¹², que são então fundidos a duas proteínas de interesse. Se essas duas proteínas interagirem, os fragmentos complementares do GFP ficam próximos o suficiente na proximidade de dobrar e montar, reconstituindo o fluoróforo GFP. O GFP reconstituído é então observado diretamente como fluorescência e indica onde ocorreu um PPI.

Como tal, tanto fret quanto BiFC dependem de grandes marcas fluorescentes que podem interromper a função da proteína marcada. Além disso, FRET e BiFC requerem expressão abundante e comparável das proteínas marcadas para obter dados precisos. Fret pode não ser adequado para experimentos onde um parceiro esteja acima do outro, o que pode levar a um fundo alto¹³. A superexpressão em experimentos BiFC também deve ser evitada, pois isso pode induzir uma montagem inespecífica¹⁴ que resulta em aumento de fundo. Ambas as técnicas requerem otimização das condições de expressão e imagem das proteínas marcadas, o que pode prolongar o tempo necessário para concluir experimentos.

O ensaio de ligadura de proximidade (PLA) é uma abordagem alternativa que pode abordar as limitações das técnicas mencionadas acima. Pla aproveita anticorpos primários que reconhecem as proteínas de interesse (ou suas etiquetas). Estes anticorpos primários são então ligados por anticorpos secundários contendo sondas oligonucleotídeas que podem hibridizar uns com os outros quando dentro de uma distância de 40 nm (ou menor)¹⁵. O DNA hibridizado resultante é amplificado através de uma reação pcr, que é detectada por sondas que complementam o DNA. Isso resulta em focos que são visualizados por um microscópio. Esta tecnologia pode detectar PPIs in situ em tecidos complexos (ou seja, a gônada do verme), que é organizado como uma linha de montagem contendo células em vários estágios de desenvolvimento e diferenciação. Com o PLA, os PPIs podem ser visualizados diretamente em uma gonada de worm fixo, o que é vantajoso para investigar se os PPIs ocorrem durante um estágio específico de desenvolvimento. O PLA oferece maior resolução dos PPIs em oposição aos ensaios baseados em co-localização, o que é ideal para fazer medições precisas. Se utilizada, a microscopia de superresolução tem o potencial de fornecer detalhes mais finos sobre a localização de focos de PLA dentro de uma célula. Outra vantagem é que os focos resultantes das reações do PLA podem ser contados por um fluxo de trabalho de análise baseado em ImageJ, tornando essa técnica quantitativa.

A família LC8 de cadeias leves de dynein foi descrita pela primeira vez como uma subunidade do complexo motor dynein¹⁶ e hipótese para servir como um adaptador de carga. Desde sua descoberta inicial, lc8 foi encontrado em múltiplos complexos proteicos, além do complexo motor dynein^17,18,19,20. A varredura de seqüências proteicas que contenham o motivo de interação LC8¹⁹ sugere que lc8 pode ter muitas interações com uma ampla gama de proteínas diferentes^{17,18,,19,,20,21,22}. Como resultado, as proteínas familiares LC8 são agora consideradas polos que ajudam a promover a montagem de grandes complexos proteicos^19,22, como conjuntos de proteínas intrinsecamente desordenadas²¹.

Uma proteína c. elegans LC8-family, dynein light chain-1 (DLC-1), é amplamente expressa em muitos tecidos e não enriquecida em estruturas subcelulares específicas^23,24. Consequentemente, a identificação de parceiros biologicamente relevantes in vivo de DLC-1 em C. elegans é desafiadora por uma série de razões: 1) co-imunoprecipitação não indica a fonte tecidual onde a interação ocorre; 2) a expressão limitada de parceiros específicos ou interações transitórias pode dificultar a capacidade de detectar uma interação por co-imunoprecipitação; e 3) a distribuição difusa do DLC-1 leva à sobreposição não específica com proteínas potenciais parceiras por co-imunocoloração. Com base nesses desafios, o PLA é uma abordagem ideal para testar interações in vivo com o DLC-1.

Foi relatado anteriormente que o DLC-1 interage diretamente e serve como cofator para as proteínas de ligação de RNA (RBPs) FBF-2²³ e GLD-1²⁵. Nosso trabalho suporta o modelo de DLC-1 servindo como uma proteína hub e sugere que o DLC-1 facilita uma rede de interação que vai além da dynein^19,22. Usando um ensaio de retirada GST, um novo RBP de interação DLC-1 chamado OMA-1 foi identificado²⁶. OOMA-1 é importante para o crescimento de oócitos e maturação meiótica²⁷ e funciona em conjunto com uma série de repressores e ativadores translacionais²⁸. Enquanto fbf-2 e GLD-1 são expressos nas células-tronco e regiões de pacitene meiotic, respectivamente, OMA-1 é expressa difusamente na germinação do pacitene meiotico através dos oócitos²⁷ (Figura 1). Isso sugere que o DLC-1 forma complexos com RBPs em diferentes regiões da gônada. Verificou-se também que a interação direta entre DLC-1 e OMA-1 observada in vitro não é recuperada por um IP in vivo. O PLA tem sido usado com sucesso como uma abordagem alternativa para estudar mais essa interação na germinação c. elegans, e os resultados sugerem que o PLA pode ser usado para sondar muitos outros PPIs no worm.