제브라피시 간 신경종 세포의 공초점 현미경 기반 레이저 절제 및 재생 분석
Summary
레이저 절제는 생물학적 시스템의 재생을 연구하는 데 널리 적용되는 기술입니다. 제시된 프로토콜은 제브라피시 측면에서 신경마비 세포를 재생시키는 레이저 절제 및 후속 시간 경과 화상 진찰을 위한 표준 레이저 스캐닝 공초점 현미경의 사용을 설명합니다.
Abstract
모발 세포는 청력의 감각을 중재하는 메카노 감각 세포입니다. 이 세포는 인간에 있는 손상 후에 재생하지 않습니다, 그러나 그(것)들은 제브라피시와 같은 비 포유류 척추동물에서 자연적으로 보충됩니다. 제브라피시 측삭 시스템은 감각적인 모발 세포 재생을 특성화하는 데 유용한 모델입니다. 측면 선은 신경 마비 세포 (INMC)의 문자열에 의해 함께 연결되는 신경 종에게 불린 머리 세포 포함 기관으로 이루어져 있습니다. INMC는 발달 도중 새로운 신경종염을 초래하는 선조 세포로 작동합니다. INMC는 세포 사멸에 의해 생성된 측면 선 시스템의 간격을 복구할 수 있습니다. INMC에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 기존의 레이저 스캐닝 공초점 현미경 및 트랜스제닉 어류를 이용한 선택적 INMC 절제를 위한 방법이 여기에 설명되어 있다. 그런 다음 시간 경과 현미경 검사법은 INMC 재생을 모니터링하고 갭 클로저 속도를 결정하는 데 사용됩니다. 이는 고성능 펄스 자외선 레이저와 같은 특수 장비가 필요하지 않은 세포 절제에 대한 접근 가능한 프로토콜을 나타냅니다. 절제 프로토콜은 많은 사용자가 이미 사용할 수있는 도구 세트를 사용하여 추가 셀 유형의 절제에 유용 할 수 있으므로 더 넓은 관심사를 제공 할 수 있습니다. 이 기술은 다른 조건및 다른 유전 배경에서 INMC 재생의 특성화를 가능하게 할 것입니다, 감각 전구 세포 재생의 이해를 발전시킬 것이다.
Introduction
대부분의 진보적 인 청력 손실의 핵심은 감각 모발 세포의 파괴, 이는 뇌에 의해 감지 신경 충진으로 외음 청각 자극을 변환. 달팽이관 머리 세포 죽음은 성인 포유동물이 손상 다음이 세포를 재생하는 기능이 부족하기 때문에 영구적 인 청력 손실을 일으킵니다. 반대로, 얼룩말물고기와 같은 비 포유류 척추동물은 음향 외상 또는 이토독성 모욕으로 잃어버린 모발 세포를 재생할 수 있습니다. 제브라피쉬 메카노감각 측면라인은 모발 세포재생1,2,3을연구하는 데 사용할 수 있는 간단하고 쉽게 조작된 기관 시스템이다.
측면 선은 신경종 세포 (INMC)로 알려진 길쭉한 세포의 문자열에 의해 개발 하는 동안 연결 하는 neuromasts 라는 작은 감각 패치로 구성 됩니다. 새로운 모발 세포 함유 장기를 초래하는 명백한 줄기 세포로서의 증식 능력을 감안할 때, INMC의 행동은 지역 사회에 큰 관심을 가지고4,5. INMC에 관한 연구의 대부분은 측면 라인 신경 주위를 감싸는 가까운 슈완 세포에 의해 그들의 확산의 억제를 특징으로하고있다, Wnt / β 카테닌 신호의 억제제를 통해 가능성이. 6,7,8. 새로운 신경종으로 INMC 증식 및 분화의 규정이 잘 설명되어 있는 동안, 절제 후에 INMC 재성장을 지배하는 기계장치는 해명되지 않았습니다. 이 프로토콜은 개별 INMC를 비난하고 후속 재생 동작을 분석하는 수단으로 작동합니다.
모발 세포를 파괴하기 위한 다양한 방법, 세포 지원, 및 전체 신경종술사, 복구 모니터링을 위한 방법론이 발표되었습니다. 화학 절제는 모발 세포에 적합하지만 CuSO4와 같은 독성 화학 물질의 투여량은 다른 측면 세포 유형9를제거하기 위해 현저하게 증가해야합니다. 형광 현미경 검사의 밑에 전기제는 재생을 공부하기 위하여 INMC를 파괴하는 효과적이고 간단한 수단이기 때문에, 좁게 표적으로 하기 어렵고, 따라서, 중요한 부수적인 손상을 생성하기 위하여 확률이 높습니다. 결과적으로 INMC 별동작(10,11)의측면을 마스크할 수 있습니다. 레이저 절제 프로토콜이 사용되었지만 평균 실험실 또는 이미징 시설(즉, 고성능 펄스 UV 레이저12)에반드시 존재하지 않는 특수 장비의 사용이 필요합니다. 여기에 설명된 방법은 일반적인 405 nm 레이저가 장착된 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 수행될 수 있으며, 일반적으로 이미징 DAPI 및 기타 블루 형광에 사용됩니다. 이 방법의 장점은 공초점 이미징은 추가 레이저 제어 시스템을 참여하거나 펄스 레이저가 장착 된 다른 현미경으로 전송하지 않고 세포 손상 직전과 후에 수행 될 수 있다는 것입니다.
유사한 방법은 얼룩말 척수(13)에서포만 신경을 위해 설명되었습니다. 그러나 이전 메서드에는 셀 절제를 위한 FRAP 모듈이 필요하며, 이 프로토콜에는 요구 사항이 없습니다. 더욱이, 상이한 세포 유형의 뚜렷한 특성(즉, 간형의 밝기, 신체 내 깊이 및 세포 형상)을 감안할 때, 사용되는 세포 유형에 따라 상당한 변형이 필요할 가능성이 높습니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 동일한 방법을 사용하여 감각 모발 세포 절제의 데모에 의해 지원되는 바와 같이 더 많은 피상적 인 세포에 효과적일 가능성이 높습니다. 또한 앞서 언급한 연구의 특징이 아닌 절제 후 INMC 회수율을 평가하기 위한 재생 분석이 설명되어 있습니다.
여기에 상세한 레이저 기반 세포 절제 프로토콜은 레이저 조건, 절제 후 이미징 및 시간 경과 현미경 검사법의 최적화를 통해 INMC의 재생 능력을 캡처합니다. 이러한 요소들은 INMC 재성장과 격차 해소를 전체적으로 종합적으로 묘사하기 위해 함께 모입니다. 이 프로토콜은 INMC를 파괴하는 데 사용되지만 셀룰러 절제에 대한 신뢰할 수 있고 효과적인 평가가 필요한 다른 작업에 적용될 수 있습니다. 그것은 또한 접근 가능한 기술, 그것은 405 nm 레이저장착 하는 모든 공초점 현미경에 실시 될 수 있기 때문에.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 거의 자외선 레이저 (405 nm 파장)가 장착 된 모든 공초점 현미경에서 수행 할 수있는 레이저 세포 절제를위한 다목적 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 전자 절제 (더 광범위한 손상을 일으키는 원인이 되는11)와펄스 UV 레이저 절제 (추가 전문 장비12필요)와같은 이전에 사용 된 방법의 한계를 해결합니다. 절제 전후 공초점 이미징은 실험의 성공에 관한 신속한 피드백을 제공합니다. 후속 시간 경과 현미경 검사는 감각 시스템 개발에 중요한 세포 유형에서 재생을위한 간단한 분석법을 제공합니다.
신경마비와 INMC에서 GFP를 강력하게 표현하는 형질전환 제브라피시(transgenic zebrafish)를 위한 사전 스크린에 매우 중요합니다. 밝은 형광과 원시 에서 파생 된 신경 종의 약 간격을 가진 애벌레는 레이저 절제에 이상적인 후보입니다. 이 물고기에서도 처음에는 탈출 감지할 수 있는 조광기 INMC가 가끔 씩씩하게 사용됩니다. 이 세포는 레이저 절제 후에 뒤에 남아 있어 INMC 사이의 진정한 간격의 형성을 방지할 수 있습니다. 디지털 게인은 405 nm 레이저 (단계 8.2)로 표적으로 할 수 있도록 사전 절제 이미징 중에 이러한 조광 세포를 밝히기 위해 조정되어야합니다.
마찬가지로, 레이저 타겟팅은 때때로 완전히 세포를 파괴하지 않습니다; 오히려 형광을 표백하여 실제 간격을 만들지 못합니다. 이 세포는 일반적으로 타임랩스 현미경 검사 의 동안 형광에서 증가할 것입니다. T-PMT이미징(그림 2)과함께 절제 후 이미징 단계의 게인 조정은 표적화된 모든 세포가 효과적으로 제거되었는지 확인하는 데 도움이 됩니다. INMC 문자열의 간격을 생성하기 위해 두 개 또는 세 개의 개별 셀 절제가 자주 필요합니다. 세포 사멸은 표적 세포에서 출혈 또는 세분화된 외관에 의해 검출될 수 있다; 하지만, 이것은 레이저 타겟팅 후 짧은 대기 기간을 요구할 수 있습니다 (그리고 어떤 경우에는 명백한 apoptotic 또는 괴사 수치가 그 직후 관찰됩니다).
이 절차의 한계는 레이저 조건이 최적화되고 INMC 재생이 성공하기 전에 여러 실험 시험을 요구할 수 있다는 것입니다. 레이저 의 레이저 전력 및 총 거주 시간은 각각 다른 샘플에 대한 약간의 조정이 필요할 수 있습니다. 그것은 과도 한 레이저 응용 자체를 복구 하는 측면 라인의 능력을 손상시킬 수 있습니다 발견 되었습니다. 여기에는 레이저 조사에 개별 세포의 1) 과다 노출이 포함되어 주변 조직에 추가 손상을 입히고 2) 문자열에 너무 많은 세포의 절제가 발생하여 더 큰 간격이 있습니다. 사용자는 파괴를 보장하고 세포를 과도하게 노출시키지 않도록 충분히 조사하는 세포 사이의 균형을 이루어야 하며, 이는 재생을 늦추거나 예방할 수 있습니다. 적절한 설정으로, INMC는 후방 측선 신경에 가시손상 없이 제거할 수 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는전자(11)와달리 이 프로토콜로 부수적인 손상이 최소화되었음을 나타낸다. 어떤 경우에도 관찰 된 간격에서 형성되는 새로운 신경 종자, 아마도 측면 라인 신경신경세포가 그대로 남아 있고 INMC6,7,8,11의증식을 억제하기 때문이다.
이러한 공초점 레이저 절제 방법은 다른 세포 유형에도 적용될 수 있으며, 특히 감각 모발 세포를 포함한 동물 내에 위치하는세포(도 4)에서특히 피상적으로 위치할 수 있음을 입증하였다. 유사한 프로토콜은 이전에 설명된13와같이 축산 재생 연구를 위한 상처 수리 또는 뉴런을 검사하기 위해 피부 세포를 축하하는 데 사용될 수 있다. 이 기술은 공초점 현미경을 가지고 있지만 레이저 절제를위한 다른 전문 장비가없는 실험실의 실험 레퍼토리에 유용한 추가될 것으로 예상됩니다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH R15 교부금 1R15DC015352-01A1 및 Pace 대학 내부 자금 조달 소스에 의해 지원되었다. 물고기 선은 블라디미르 코르즈14,케이티 킨트15,16,그리고 A. 제임스 허드스페스의 실험실의 호의였다. 우리는 이러한 실험에 대한 피드백에 대한 A. 제임스 허드스페스와 그의 그룹의 구성원, 그리고 그들의 지원에 대한 페이스 대학의 동료에게 감사드립니다. RStudio의 물류 회귀 분석은 특히 동료 매튜 아이엘로-램멘스의 도움을 받았습니다.
Materials
| 12-well PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Sciences | 63425-05 | |
| 15 mM Tricaine stock solution | Sigma | E10521 | 15 mM Tricaine in reverse osmosis water |
| 1X E3 + 600 µM Tricaine | Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media | ||
| 1X E3 media | Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L) | ||
| 60 X E3 media | All components purchased from Sigma-Aldrich | 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water | |
| Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence | Olympus | ||
| LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers | Carl Zeiss Microscopy, LLC | A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40 | |
| FIJI/ImageJ Image processing software | Multiple contributors | Downloadable at https://fiji.sc/ | |
| Dissecting needle modified into hair knife | Fisher Scientific | 19010 | An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle |
| Microsoft Excel software | Microsoft Corp. | Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel | |
| Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window | Mattek Corporation | P35G-1.5-20-C | 35 mm petri dish, 20 mm glass window |
| Immersol 518F Immersion Oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Low Gelling Agarose | Sigma Life Science | A9414-256 | |
| Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert | Millipore Sigma | CLS3479-48EA | |
| Rstudio software | Rstudio PBC | Downloadable at https://rstudio.com/ | |
| SMX-168-BL Stereo microscope | Motic | ||
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| ZEN software | Carl Zeiss Microscopy, LLC |
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