ゼブラフィッシュインターニューロマスト細胞における共焦点顕微鏡ベースレーザーアブレーションと再生アッセイ

すべての動物の仕事は、プロトコル2018-1の下でペース大学の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。 1. ゼブラフィッシュ幼虫の準備 実験を行う3~5日前に交配を設定し、レーザーアブレーション用に取り付けると幼虫は2日受精後(dpf)から4dpfの年齢になります。注:Et(krt4:EGFP)sqEt20(ET20と略称)エンハンサートラップラインは、神経間肥満細胞が強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)で明確に標識され、比較的容易な細胞同定およびアブレーション11、14を可能にする。レーザーアブレーション特異性と柔軟性の確認のために、ET20魚はTg(neuroD:tdTomato)魚で飼育され、横線神経は赤い蛍光タンパク質で標識されるか、Tg(myo6b:βactin-GFP)でGFP15,16で感覚性の毛細胞を標識します。 翌日の胚採取後、0.0001%メチレンブルーを含むE3培地で28.5°Cで、麻酔と装着の準備ができるまで胚をインキュベートする。 2. 低ゲル化アガロースおよびトリケイン溶液の調製 250 mL ガラスのエルレンマイヤーフラスコに、48 mLの 1x E3培地、2 mL の 15 mM トリケーヌストック溶液、および 0.5 g の低融解アガロースを加えます。 溶液を30sの高い上に電子レンジし、(熱保護手袋を着用して)渦巻き、アガロースを溶解する。アガロースが完全に溶解するまで30sの加熱サイクルを繰り返します。 アガロースを42°Cに加熱したインキュベーターに保管し、使用できる状態になるまで保管します。 3. ゼブラフィッシュ幼虫の麻酔 50 mLの円錐形チューブに、600 μMの最終濃度に1x E3培地24 mLと1mLのトリカインストック溶液(15 mM)を加えます。 600 μM トリカインを含む E3 の 8 mL で平底の細胞培養プレートの 6 つのウェルのうちの 1 つをロードします。 トランスファーピペットを使用してゼブラフィッシュの幼虫を74 μmメッシュ底の転写インサートに移動します。 メッシュ底のインサートをE3+トリカイン溶液を含む6ウェルプレートのウェルに移します。幼虫は最低3分間、または完全に麻酔されるまで井戸に留まる。インサートをタップして麻酔をテストします。幼虫はタップに応じて驚いて泳ぐべきではありません。 4. 麻酔ゼブラフィッシュ幼虫の蛍光スクリーニング ピペット1麻酔幼虫は、スクリーニング用に12ウェル疎水性コーティングスライドに十分に上に1つ当たり。スクリーニング時の光学的歪みを低減するために、スライドの各ウェルに形成される半月板の湾曲が最小限であることを確認してください。これは幼虫を置いた後、各ウェルからE3の小さなボリュームを除去することによって行うことができます。 直立した顕微鏡(水銀アーク灯、金属ハライドランプ、またはLED光源および適切なフィルターキューブを装備した)上の10xの目的の下で、横線システムの神経マストおよび神経間肥満細胞でeGFPを発現する幼虫のためのスクリーン。 より強い発現を持つ幼虫を選択すると、より明るいeGFPが得られ、これはおそらくトランスジーンのホモ接合性である。注:ET20ラインでは、eGFPは、各神経マストを取り囲むマントル細胞のリングと、これらの器官を接続するニューロマスト間細胞の狭いストリップで表現されています。より強いeGFP発現(蛍光の明るさ)は、より効果的なアブレーションに寄与する。 アブレーションの特異性を調べるには、ET20と Tg(neuroD:tdTomato) のトランスジーンの両方で二重トランスジェニック幼虫を使用してください。 Tg(neuroD:tdTomato) キャリアのスクリーニングの場合は、RFPフィルターキューブセットを使用して、後方の横線神経節を表す耳の後部に真っ赤なパッチを識別します。 横線神経マストの毛細胞をアブラレートするには 、Tg(myo6b:βactin-GFP) トランスジェニックラインとスクリーンを使用して、各神経マストの中央にGFP局在化します。 神経マストのステレオタイプ間隔を持つ幼虫を選択します。神経マスト間の間隔の違いは、発達中の異常な神経マスト沈着を示し、横線プリモジウム17における遊動行動または細胞増殖の欠陥を示唆する。このような欠陥は、アブレーション後のINMCの回遊または再生行動にも影響を及ぼす可能性があります。注意:間隔の一般的な欠陥は、最初の移行プリモジウム(prim1L1)によって堆積する前神経マスト(prim1L1)と同じプリモジウム(prim1L2)によって堆積される第2の神経マストとの間の異常に大きな距離を含み、しばしば後部神経マストの混雑に関連する。 5. レーザーアブレーションとイメージング用の幼虫の取り付け ピペット3 – 4麻酔幼虫は、カバースリップボトム皿(14 mm番号1.5カバースリップ付き35mm皿)の中央にあるE3/tricaine溶液の小さな液滴に。余分な溶液を取り除き、幼虫が小さな液滴に残るように、それらを含むのに十分な大きさにします。 双眼鏡ステレオ顕微鏡のステージに皿を移し、すべての幼虫が視野にあるようにズームとフォーカスを操作します。 加熱されたインキュベーターから低融点アガロースを含むエルレンマイヤーフラスコを取り除きます。トランスファーピペットを使用して、カバースライドにアガロース溶液を移し、薄い層を作り出します。液体がちょうど皿の底の井戸を満たすまで余分なアガロースを引き出し、幼虫を吸引しないように注意してください。 アガロース溶液の幼虫をヘアナイフまたはヘアループを使用して素早く配置し、互いに整列し、左にrostralを向けます。 毛髪ナイフで幼虫をガラスにそっと押し付け、右側を下にしてプロフィールに横たわります。3dpfより古い幼虫は、膨張した水泳膀胱のために浮遊する傾向があるので、アガロースがゲル化し始めるまでガラスに繰り返し押し付ける必要があるかもしれません。 約60sの後、アガロースは固化し始め、幼虫は向きを変えることができない。カバースリップのアガロースが完全に固化するまで、室温で約5分待ちます。アガロースが固まったら、トランスファーピペットを使用して、1xトリカインを含むE3で途中で皿を満たします。 6. 将来のターゲットとアブレーション前のイメージングを見つける レーザースキャン共焦点顕微鏡システムの電源を入れ、統合イメージングソフトウェアを使用して初期化します。63倍のプラン-アポクロマート油浸漬目的(数値開口1.40)または類似を選択します。浸漬油を塗布し、幼虫が左に彼らのrostralの側面を持つような円形の段階の挿入物で皿を固定します。 明視野または差動干渉コントラスト照明の下で、撮像用に取り付けられた幼虫の1つを選択します。カバースリップに最も近い魚の側面の皮膚が焦点を合わせ、ペライダーム細胞の指紋状のパターンで認識できるようにフォーカスノブでフォーカスを調整します。 フォーカスが入ったら、GFP チャンネルの蛍光照明に切り替えます。水平筋皮下に沿ってGFP発現により後方横線を見つける。蛍光細胞の環は神経マストマントル細胞を示し、細胞の細長鎖は神経間肥満細胞である。 通常、卵黄に対する単なる後ろ方向に位置するprimIL1ニューロマストから始まり、ステージコントロールジョイスティックまたは他のステージ移動コントロールを使用して、水平ミオセプタムに沿って走査する。 プリムIL3とprimIL4(L3およびL4)神経マストの間の領域に到達するまで、神経間細胞の文字列に従ってください(図1A)。注: 他の領域もターゲットにすることもできますが、幹と尾部のこのセクションはカバー ガラスに最も近い傾向があり、したがってアブレーションに最も適しています。 複数の幼虫をイメージングする場合は、最初のステージ位置を設定し、適切なチェックボックスを選択解除して複数ステージ位置オプションを無効にします。 ステップ 6.4.1 ~ 6.4.2 を繰り返します。各所望の段階位置(各幼虫)のために。 L3–L4領域のセルボディが特定されたら、取得モードに切り替えます。 488 nm または 491 nm レーザーを使用して、GFP イメージング トラックをアクティブにします。 「イメージングセットアップ」ドロップダウンメニューのT-PMTチェックボックスをオンにして、アクティブ化された488 nmレーザートラックに送信光(透過光増倍管またはT-PMT)チャンネルを追加します。 レーザーパワーを6%、ピンホールサイズを1 Airyユニット相当に、デジタルゲインを750に設定してET20幼虫を撮影します。正確なゲインとレーザーパワーは、カバースリップにどれだけ近い、蛍光の明るさによって、任意の幼虫のために異なる場合があります。それ以外の場合は薄暗い投影やフィリポディアをキャプチャするために、セルのボディが飽和するようにゲインを調整します。 パラメータをフレームサイズ1024×1024ピクセル、デジタルズーム0.7(145.2 μm x 145.2 μmの画像サイズ)に調整します。画像の品質を向上させるために、平均を 2 に設定します。 Z-スタックボックスをチェックして、Z位置のドロップダウンメニューを表示します。高速スキャン中, 神経間肥満細胞がちょうど焦点を合わせなくなるまで焦点を合わせます。最初のスライスを設定し、ニューロマスト細胞が再び焦点を合わせなくなるまでサンプルを通して焦点を合わせます。最後のスライスを設定します。約25μmのzスタックを含むようにしてください。イメージング間隔を1μmに設定します。 実験を開始して、アブレーション前の z スタックをキャプチャします (図 1B)。ステージ位置が追加されている場合は、位置オプションを無効にして、現在の位置のみがイメージされるようにします。キャプチャ後にファイルを保存します。 7. 細胞体のレーザーアブレーション [すべてのツールを表示]をクリックします。このオプションは、取得インターフェイスの上部にあります。 「イメージング設定」のドロップダウンメニューをクリックします。[イメージングの設定] で、[新しいトラックを追加](+”と表示される) をクリックします。 [イメージング設定] で、[Dye]のドロップダウンメニューをクリックします。染料として DAPI を選択します。 [チャンネル] のドロップダウン メニューをクリックし、それぞれのチェックボックスをオフにして他のすべてのトラックの選択を解除します。DAPI トラックのみが選択されていることを確認します。 DAPI トラックで、405 をクリックして”レーザー設定”。レーザーパワーを75%に上げます。候補セルボディをスキャンしてアブレーションをスキャンしている間、DAPI チャネルをクリック解除してレーザーをオフにします。 視野を中心とした神経間肥満細胞の体を中心に、スキャンフレームを20x-22倍に拡大します。ズームを適用する際に、セル本体を中央に保つために、フレームの位置を調整する必要がある場合があります。セル本体が視野に入り込んだら、ライブスキャンを停止します。注: セルの本文は、視野全体を占める必要があります。このズームレベルでは、GFPは急速に漂白します。迅速に作業することで、レーザー露出時間を最小限に抑えます。関心のある領域を選択するのではなく、ズームを使用して、小さな領域でレーザーの電力分布を増加させます。 405 nmレーザーシャッターボックスをチェックして、トラックをアクティブにします。レーザーパワーを75%に調整します。45 s のタイマーを設定します。連続スキャンを有効にして、タイマーを開始します。45 s ですぐにスキャンを停止します。 8. 回生を研究するためのアブレーション後のイメージングとタイムラプス顕微鏡 “チャンネル” のドロップダウン メニューをクリックします。チャンネルで、アブレーションレーザーを無効にするには、”DAPI”トラックをクリック解除します。取得モードのドロップダウンメニューをクリックします。 取得モードで、クリックして “ズーム” . スライダを使用するか、または「0.7」と入力して、ズームを0.7に縮小します。 セルアブレーションを成功させるには、ゲインを900に増やし、視野を高速スキャンします。注: GFP は、対象のセル内に表示されません。それでも蛍光が観察される場合は、ステップ7.1~7.3に戻ります。 アブレーション前のイメージングで説明されているものと同じまたは類似した設定を使用して、アブレーション後の画像をキャプチャして保存します(図1C)。画像が蛍光細胞または除去する必要がある追加の細胞体の残骸を明らかにした場合は、レーザーアブレーションステップを繰り返して、神経間肥満細胞の文字列に目に見えるギャップを作り出します。 T-PMTチャンネル画像を調べて、細胞の損傷をさらに確認します。損傷した細胞は粒状の外観を持ち、しばしば核が膨らんだり、不規則な形になる(図2)。 アブレーション前画像を撮像し、必要に応じて細胞をアブレーションし、個々のステージ位置ごとにアブレーション後画像をキャプチャした後、画像キャプチャのステージ位置と時間オプションの両方を活性化してタイムラプス顕微鏡を設定する。時間パラメータを 24 時間または別の目的のエンドポイントと 15 分間隔に設定します。実験を開始して画像を取得し、完了時に結果のファイルを保存します (翌日)。 幼虫をさらに研究または上げる場合は、細かい鉗子を使用してアガロースから慎重に除去し、回復のためにトリカインなしでE3培地に移します。それ以上使用しない場合は、承認された動物プロトコル(氷浴中の急速かつ持続的な浸漬は一般的な方法である)に従って安楽死させ、機関の要求に応じてそれらを処分する。 9. 画像解析 推奨イメージ処理ソフトウェア (表/材料) でアブレーション後の z スタック ファイルを開きます。各チャネルが別々の表示ウィンドウに表示されるようにチャネルを分割します。 GFP チャネル ウィンドウで、ライン ツールを使用して、残りの INMC の先端の間に直線を描画します。これは、z スタックを上下にスクロールするか、線を描画する前に最大強度の投影を実行することによって支援される場合があります。 X 平面と Y 平面の INMC 端点間の距離を取得するには、[計測] ツールを使用します。 元の z スタックの Z スライスをスクロールして、Z 平面内の INMCs 間の距離を決定します。 ピタゴラス定理(a 2 + b 2 =c2)を使用してINMC端間の全距離を計算します。斜辺は、全体の距離(またはギャップサイズ)です。 結果の距離計測値をスプレッドシート アプリケーションに入力して、データ分析を行います。 コンフォーカルシステムの統合イメージングソフトウェアまたは自由に利用可能な画像解析ソフトウェアを使用して、ステップ8.2-8.3で収集されたタイムラプス顕微鏡ファイルを確認します。細胞投影によって神経間肥満細胞間のギャップが埋まった時点を特定する。これは、複数のzスライスを調べて、すべての次元のギャップの閉鎖を確認することで助けることができます。 ギャップの閉じるまでの時間を最も正確に測定するには、アブレーション後の画像のタイムスタンプ(Finder またはエクスプローラーで表示)をゼロタイムポイントとして使用します。タイムラプスイメージスタックの最初から時間を測定すると、追加のステージポジションを明示している間に経過した時間に応じて、閉鎖までの時間が過ぎる可能性があります。 元のギャップサイズ(μm)を完全なギャップ閉鎖に必要な時間または分で割るだけで、閉鎖率を導き出します。