الاستئصال الليزري القائم على المجهر والتجدد في خلايا الحمار الوحشي Interneuromast
Summary
الاستئصال بالليزر هو تقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة التجديد في النظم البيولوجية. يصف البروتوكول المعروض استخدام مجهر confocal المسح الضوئي بالليزر القياسي للاستئصال بالليزر والتصوير اللاحق للفاصل الزمني للخلايا المُتدرِّب في الخط الجانبي للحمار الوحشي.
Abstract
خلايا الشعر هي خلايا ميكانيكية تتوسط في الشعور بالسمع. لا تتجدد هذه الخلايا بعد تلف البشر، ولكنها تتجدد بشكل طبيعي في الفقاريات غير الثديية مثل الحمار الوحشي. نظام خط الوحشية الجانبي هو نموذج مفيد لتميز تجديد خلايا الشعر الحسية. يتكون الخط الجانبي من أعضاء تحتوي على خلايا الشعر تسمى الاعصاب، والتي ترتبط معا من قبل سلسلة من الخلايا الأرتورومية (INMCs). تعمل INMCs كخلايا سلف تؤدي إلى ظهور اعصاب جديدة أثناء التطوير. يمكن للـ INMCs إصلاح الثغرات في نظام الخط الجانبي الذي تم إنشاؤه بواسطة موت الخلايا. وهناك طريقة موصوفة هنا للاستئصال الانتقائي للفحص في الميك أو الميك أو الميكون باستخدام مجهر خلطات تقليدية مسح الليزر والأسماك المعدلة وراثياً التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر في الـ INMCs. ثم يتم استخدام المجهر الفاصل الزمني لمراقبة تجديد INMC وتحديد معدل إغلاق الفجوة. وهذا يمثل بروتوكولاً يمكن الوصول إليه لاجتثاث الخلايا لا يتطلب معدات متخصصة، مثل ليزر فوق البنفسجي النبضي عالي الطاقة. قد يخدم بروتوكول الاستئصال مصالح أوسع، حيث قد يكون مفيدًا في إزالة أنواع الخلايا الإضافية، باستخدام مجموعة أدوات متوفرة بالفعل للعديد من المستخدمين. وستمكن هذه التقنية من توصيف تجديد الـ INMC في ظل ظروف مختلفة ومن خلفيات جينية مختلفة، مما سينهض بفهم تجديد الخلايا الناذرة الحسية.
Introduction
في جوهر فقدان السمع الأكثر تقدمية يكمن في تدمير خلايا الشعر الحسية، التي تنقل المحفزات السمعية الخارجية إلى نبضات عصبية يمكن اكتشافها من قبل الدماغ. يسبب موت خلايا الشعر القوقعة فقدان السمع الدائم، حيث تفتقر الثدييات البالغة إلى القدرة على تجديد هذه الخلايا بعد الضرر. وعلى العكس من ذلك، يمكن للفقاريات غير الثديية مثل سمك الحمار الوحشي تجديد خلايا الشعر المفقودة بسبب الصدمة الصوتية أو الإهانة السامة للثدي. خط الحمار الوحشي ميانوسنسنسوري الجانبي هو نظام الجهاز بسيطة والتلاعب بها بسهولة التي يمكن استخدامها لدراسة تجديد خلايا الشعر1,2,3.
يتكون الخط الجانبي من بقع حسية صغيرة تسمى الزمرات العصبية ، والتي ترتبط أثناء التطوير بواسطة سلسلة من الخلايا الممدودة المعروفة باسم الخلايا الأرومية (INMCs). نظرا لقدرتها على الانتشار كخلايا جذعية واضحة تؤدي إلى ظهور أجهزة جديدة تحتوي على خلايا الشعر ، فإن سلوك INMCs له أهمية كبيرة للمجتمع4،5. وقد اتسم الكثير من البحوث المتعلقة INMCs قمع انتشارها من قبل الخلايا شوان القريبة التي تلتف حول العصب الخط الجانبي، على الأرجح من خلال مثبطات لإشارات Wnt/β-catenin. 6,7,8. وفي حين أن تنظيم انتشار الـ INMC والتمايز إلى أشكال عصبية جديدة قد تم وصفه بشكل جيد، فإن الآليات التي تحكم نمو INMC بعد الاستئصال لم يتم توضيحها. هذا البروتوكول بمثابة وسيلة لـ ablating INMCs الفردية وتحليل سلوكهم التجدد اللاحقة.
وقد نشرت مجموعة متنوعة من الطرق لتدمير خلايا الشعر، والخلايا الداعمة، وs neuromasts بأكملها، جنبا إلى جنب مع منهجيات لرصد الانتعاش. الاجتثاث الكيميائي يعمل بشكل جيد لخلايا الشعر، ولكن جرعات من المواد الكيميائية السامة مثل CuSO4 يجب أن تزيد بشكل كبير لإزالة أنواع الخلايا الخط الجانبي الأخرى9. وفي حين أن الاستئصال الكهربائي تحت المجهر المفلور هو وسيلة فعالة وبسيطة لتدمير الـ INMCs لدراسة التجديد، فمن الصعب استهدافه بشكل ضيق، ومن المرجح بالتالي أن يؤدي إلى أضرار جانبية كبيرة. ونتيجة لذلك، يمكن أن يخفي هذا جوانب من السلوكيات الخاصة بـ INMC10,11. وقد استخدمت بروتوكولات الاستئصال بالليزر، ولكنها تتطلب استخدام معدات متخصصة غير موجودة بالضرورة في المختبر العادي أو مرفق التصوير (أي أشعة الليزر النبضية عالية الطاقة12). ويمكن تنفيذ الطريقة المذكورة هنا مع أي مجهر بالليزر المسح confocal مجهزة ليزر 405 نانومتر المشتركة، وعادة ما تستخدم لتصوير DAPI وغيرها من الفلوروفوريس الزرقاء. ومن مزايا هذه الطريقة أن التصوير confocal يمكن أن يؤدي مباشرة قبل وبعد تلف الخلايا دون إشراك أي أنظمة تحكم الليزر إضافية أو نقل إلى مجهر آخر مجهزة ليزر نبضي.
وقد وصفت طريقة مماثلة للخلايا العصبية ablating في الحبل الشوكي حمار وحشي13. ومع ذلك، يتطلب الأسلوب السابق وحدة نمطية FRAP لاجتثاث الخلية، وهو ليس مطلباً لهذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، ونظرا لخصائص متميزة لأنواع مختلفة من الخلايا (أي سطوع الفلورس عبرجين، عمق داخل الجسم، وشكل الخلية)، فمن المرجح أن تكون هناك حاجة إلى تعديلات كبيرة اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة. البروتوكول مفصلة هنا هو أكثر عرضة لتكون فعالة للخلايا أكثر سطحية، كما يدعمها مظاهرة من الاستئصال الخلوية الشعر الحسية باستخدام نفس الطريقة. كما تم توضيحها هو فحص التجديد لتقييم معدلات الانتعاش INMC بعد الاجتثاث، والتي لم تكن سمة من سمات الدراسة المذكورة أعلاه.
بروتوكول استئصال الخلايا القائم على الليزر المفصل هنا يلتقط القدرة التجديدية للـ INMCs من خلال تحسين ظروف الليزر والتصوير قبل والاستئصال بعد الاستئصال والمجهر الفاصل الزمني. هذه العناصر معا لتصوير شامل INMC إعادة النمو وإغلاق الفجوة في مجملها. بينما يتم استخدام هذا البروتوكول هنا لتدمير INMCs، فإنه يمكن تطبيقه على عمل آخر يتطلب تقييمًا موثوقًا وفعالًا للاستئصال الخلوي. بل هو أيضا تكنولوجيا يمكن الوصول إليها، لأنه يمكن إجراؤها على أي مجهر confocal مجهزة ليزر 405 نانومتر.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول طريقة متعددة الاستخدامات لاجتثاث الخلايا بالليزر التي يمكن إجراؤها على أي مجهر خلطي مجهز بالليزر شبه فوق البنفسجي (طول موجي 405 نانومتر). يتناول هذا البروتوكول قيود الأساليب المستخدمة سابقاً مثل الاستئصال الكهربائي (الذي يسبب أضرارًا أكثر انتشارًا11)والاستئصال النبضي بالليزر للأشعة فوق البنفسجية (الذي يتطلب معدات متخصصة إضافية12). قبل وما بعد الاستئصال التصوير confocal تقديم ردود فعل سريعة بشأن نجاح التجربة. يقدم المجهر الفاصل الزمني اللاحقة مقايسة بسيطة للتجديد في نوع الخلية الحرجة لتطوير النظام الحسي.
ومن الأهمية بمكان أن يتم إجراء فحص مسبق للسمك الوحشي المعدل وراثياً الذي يعبر عن GFP بقوة في سحيقات الأعصاب و INMCs. اليرقات مع الفلوري مشرق والمباعدة حتى تقريبا من الاعصاب المشتقة من الطراز الأولي هي المرشحين المثاليين للاستئصال بالليزر. حتى في هذه الأسماك، هناك أحياناً باهتة INMCs التي قد في أول كشف الهروب. يمكن أن تبقى هذه الخلايا وراء بعد الاستئصال بالليزر، ومنع تشكيل فجوة حقيقية بين INMCs. وينبغي تعديل الكسب الرقمي للكشف عن هذه الخلايا المختف أثناء التصوير قبل الاستئصال بحيث يمكن أيضا أن تكون مستهدفة مع الليزر 405 نانومتر (الخطوة 8.2).
وبالمثل، فإن استهداف الليزر في بعض الأحيان لن يدمر الخلية بالكامل؛ بل سيدمر الخلايا بشكل كامل. بدلا من ذلك ، فإنه سيتم تبييض الفلوريسنس ، مما أدى إلى فشل في خلق فجوة حقيقية. هذه الخلايا سوف تزيد عموما في الفلوريسنس أثناء المجهر timelapse. يساعد التعديل في عملية التصوير بعد الاستئصال مع التصوير T-PMT(الشكل 2)على ضمان إزالة جميع الخلايا المستهدفة بشكل فعال. فإنه يتطلب بشكل متكرر اثنين أو ثلاثة الاجتثاثات الخلية الفردية لإنتاج فجوة في سلسلة INMC. يمكن الكشف عن موت الخلايا عن طريق blebbing أو مظهر محبب في الخلايا المستهدفة؛ على الرغم من أن هذا قد يتطلب فترة انتظار قصيرة بعد استهداف الليزر (وفي بعض الحالات ، يتم ملاحظة شخصيات مُنقبة أو نخرية بعد ذلك بوقت قصير).
ومن القيود التي يفرضها هذا الإجراء أنه قد يتطلب إجراء تجارب تجريبية متعددة قبل أن يتم تحسين ظروف الليزر ونجاح تجديد INMC. قد تتطلب قوة الليزر ووقت الإقامة الكلي لليزر كل تعديل طفيف لعينات مختلفة. وقد وجد أن تطبيق الليزر المفرط يمكن أن يضعف قدرة الخط الجانبي لإصلاح نفسه. وهذا يشمل كلا من 1) التعرض المفرط للخلايا الفردية للإشعاع بالليزر، ويفترض أن يسبب ضررا إضافيا للأنسجة المحيطة بها، وكذلك 2) استئصال خلايا كثيرة جدا في السلسلة، مما يؤدي إلى فجوة أكبر. يجب على المستخدمين تحقيق التوازن بين الخلايا تشعيع بما فيه الكفاية لضمان تدميرها وليس الإفراط في تعريض الخلايا، والتي يمكن أن تبطئ أو تمنع التجديد. مع الإعدادات المناسبة، فقد وجد أنه يمكن إزالة INMCs دون ضرر مرئي للأعصاب الخط الجانبي الخلفي، مما يشير إلى أن الأضرار الجانبية يتم تقليلها مع هذا البروتوكول على عكس الاستئصال الكهربائي11. في أي حال من الحالات كانت العصبية الجديدة تشكل في الفجوة الملاحظة، ويفترض أن لأن العصب الخط الجانبي لا تزال سليمة والخلايا الدبقية الكامنة لا تزال وتمنع انتشار INMCs6،7،8،11.
وقد ثبت أن هذه الطريقة من الاستئصال بالليزر confocal يمكن تطبيقها على أنواع الخلايا الأخرى أيضا، لا سيما في تلك الموجودة سطحيا داخل الحيوان بما في ذلك خلايا الشعر الحسية (الشكل 4). ويمكن استخدام بروتوكول مماثل لاستئصال خلايا الجلد لفحص إصلاح الجروح أو الخلايا العصبية لدراسات تجديد محور عصبي, كما سبق وصفه13. ومن المتوقع أن تصبح هذه التقنية إضافة مفيدة إلى الذخيرة التجريبية للمختبرات التي تمتلك مجهراً confocal ولكن لا معدات متخصصة أخرى للاستئصال بالليزر.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة R15 منحة 1R15DC015352-01A1 و بيس جامعة مصادر التمويل الداخلي. وكانت خطوط الأسماك مجاملة من فلاديمير Korzh14, كاتي كيندت15,16, ومختبر A. جيمس Hudspeth. ونود أن نشكر أ. جيمس هودسبيث وأعضاء مجموعته على تعليقاتهم على هذه التجارب، والزملاء في جامعة بيس على دعمهم. وقد ساعد تحليل الانحدار اللوجستي في جمهورية صربسكا على وجه الخصوص من زميلنا ماثيو آيلو – لامنس.
Materials
| 12-well PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Sciences | 63425-05 | |
| 15 mM Tricaine stock solution | Sigma | E10521 | 15 mM Tricaine in reverse osmosis water |
| 1X E3 + 600 µM Tricaine | Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media | ||
| 1X E3 media | Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L) | ||
| 60 X E3 media | All components purchased from Sigma-Aldrich | 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water | |
| Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence | Olympus | ||
| LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers | Carl Zeiss Microscopy, LLC | A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40 | |
| FIJI/ImageJ Image processing software | Multiple contributors | Downloadable at https://fiji.sc/ | |
| Dissecting needle modified into hair knife | Fisher Scientific | 19010 | An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle |
| Microsoft Excel software | Microsoft Corp. | Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel | |
| Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window | Mattek Corporation | P35G-1.5-20-C | 35 mm petri dish, 20 mm glass window |
| Immersol 518F Immersion Oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Low Gelling Agarose | Sigma Life Science | A9414-256 | |
| Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert | Millipore Sigma | CLS3479-48EA | |
| Rstudio software | Rstudio PBC | Downloadable at https://rstudio.com/ | |
| SMX-168-BL Stereo microscope | Motic | ||
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| ZEN software | Carl Zeiss Microscopy, LLC |
References
- Denans, N., Baek, S., Piotrowski, T. Comparing Sensory Organs to Define the Path for Hair Cell Regeneration. Annual Review Cell & Developmental Biology. 35, 567-589 (2019).
- Ghysen, A., Dambly-Chaudiere, C. The lateral line microcosmos. Genes & Development. 21 (17), 2118-2130 (2007).
- Lush, M. E., Piotrowski, T. Sensory hair cell regeneration in the zebrafish lateral line. Dev Dyn. 243 (10), 1187-1202 (2014).
- Ledent, V. Postembryonic development of the posterior lateral line in zebrafish. Development. 129 (3), 597-604 (2002).
- Nunez, V. A., et al. Postembryonic development of the posterior lateral line in the zebrafish. Evolution and Development. 11 (4), 391-404 (2009).
- Grant, K. A., Raible, D. W., Piotrowski, T. Regulation of latent sensory hair cell precursors by glia in the zebrafish lateral line. Neuron. 45 (1), 69-80 (2005).
- Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. Supernumerary neuromasts in the posterior lateral line of zebrafish lacking peripheral glia. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 102 (5), 1496-1501 (2005).
- Lush, M. E., Piotrowski, T. ErbB expressing Schwann cells control lateral line progenitor cells via non-cell-autonomous regulation of Wnt/beta-catenin. eLife. 3, 01832 (2014).
- Hernandez, P. P., et al. Sublethal concentrations of waterborne copper induce cellular stress and cell death in zebrafish embryos and larvae. Biological Research. 44 (1), 7-15 (2011).
- Moya-Diaz, J., et al. Electroablation: a method for neurectomy and localized tissue injury. BMC Developmental Biology. 14, 7 (2014).
- Sanchez, M., Ceci, M. L., Gutierrez, D., Anguita-Salinas, C., Allende, M. L. Mechanosensory organ regeneration in zebrafish depends on a population of multipotent progenitor cells kept latent by Schwann cells. BMC Biology. 14, 27 (2016).
- Viader-Llargues, O., Lupperger, V., Pola-Morell, L., Marr, C., Lopez-Schier, H. Live cell-lineage tracing and machine learning reveal patterns of organ regeneration. eLife. 7, (2018).
- Morsch, M., et al. Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Developmental Dynamics. 231 (2), 449-459 (2004).
- Kindt, K. S., Finch, G., Nicolson, T. Kinocilia mediate mechanosensitivity in developing zebrafish hair cells. Developmental Cell. 23 (2), 329-341 (2012).
- Toro, C., et al. Dopamine Modulates the Activity of Sensory Hair Cells. Journal of Neurosciences. 35 (50), 16494-16503 (2015).
- Dalle Nogare, D., Chitnis, A. B. A framework for understanding morphogenesis and migration of the zebrafish posterior Lateral Line primordium. Mechanisms of Development. 148, 69-78 (2017).
