Usando uma biópsia química para avaliação da qualidade do enxerto

A avaliação da qualidade dos órgãos continua sendo um grande desafio para os médicos, que devem tomar decisões rápidas e informadas sobre se um determinado órgão é viável para transplante ou se deve ser descartado. Múltiplos fatores, como idade do doador, duração da isquemia e infecções e processos inflamatórios, podem afetar o desfecho do enxerto a longo prazo. Embora diversos métodos tenham sido desenvolvidos até o momento para diagnosticar a função de aloenxerto renal, a inspeção histopatológica continua sendo o padrão-ouro nessa matéria^3,4,12. Embora o procedimento de biópsia possa produzir informações significativas sobre doenças de doadores pré-existentes e alterações vasculares, não está livre de falhas. Os erros amostrais associados à variabilidade do interobservador e à amostragem de glomeruli insuficiente para informações abrangentes sobre a função do órgão permanecem preocupações típicas a esse respeito. Além disso, a preparação do espécime traz algumas questões como uma avaliação incompleta do enxerto em caso de seções congeladas e extensão do tempo de procedimento para secção de parafina. No entanto, o risco aumentado de hemorragia, que pode aparecer agudamente como hematuria microscópica ou bruta, é a principal complicação de risco de vida associada ao procedimento de biópsia. Por essa razão, o número de biópsias permitidas é estritamente limitado nos procedimentos de transplante, fator que dificulta a captura de mudanças dinâmicas e análises de séries temporativas através deste método^12,,13,,14. Os benefícios de uma análise histológica devem ser ponderados em relação aos riscos associados à metodologia. O valor dos achados histológicos é indiscutível, mas não explicam os mecanismos moleculares das aberrações.

Metabolômica e lipidomics são os domínios mais jovens da família científica “-omics”. O conjunto completo de metabólitos e lipílitos humanos de baixa molecular (<1.200 Da) conectados dentro de uma rede metabólica é definido como um metabolome humano. O genoma permanece relativamente constante ao longo de sua vida, com pequenas modificações causadas por mutações que ocorrem raramente. O metabolome é o produto da expressão genética, que é altamente sensível a mudanças em todos os processos biológicos, bem como fatores ambientais. A natureza dinâmica dos metabólitos e lipídios torna-os indicadores perfeitos da condição atual do órgão^7,,8,,15,16. O método SPME proposto no protocolo acima mencionado permite a detecção de alterações ocorridas no órgão durante sua preservação, desde a remoção do órgão do corpo do doador até a revascularização no receptor. O pequeno diâmetro da sonda (~200 μm) proporciona invasividade mínima e permite várias amostras do mesmo órgão sem causar qualquer dano ao tecido. A realização de estudos utilizando rim, como órgão mais frequentemente transplantado, permite uma melhor compreensão e caracterização das vias metabólicas responsáveis pela diminuição da qualidade e função dos enxertos. A possibilidade de monitorar modificações ao longo do tempo certamente é uma vantagem importante da técnica em comparação com métodos invasivos convencionais, como a biópsia. A análise apresentada atualmente identificou concentrações alteradas de vários grupos de lipídios e metabólitos, especialmente de aminoácidos essenciais, purinas, nucleosídeos de purina e glicerofosfolipídios. Esses resultados são consistentes com os relatórios anteriores de análise tecidual^{5,,6,17,,18,19,20}. Até o momento, a maioria dos relatórios científicos utilizando metabolômica ou lipidomífica para explicar processos que induzem complicações após transplante ou isquemia/lesão por reperfusão (IRI) foram limitados à análise dos fenômenos biofluidos^21,,22,,23.

Cada aplicação clínica requer otimização do protocolo amostral para garantir que o desempenho do método analítico atenda aos critérios esperados. Nesse sentido, o benefício da utilização do SPME é a possibilidade de ajuste de condições para diversos projetos experimentais. A variedade de fases de extração acessíveis fornece um amplo espectro de metabólitos extraídos com polaridades diversificadas. Ao mesmo tempo, isso pode ser considerado como uma limitação do método devido ao fato de que cada sorbent fornece seletividade para características específicas e não extrai todos os compostos presentes na matriz amostral. Deve-se notar que os revestimentos SPME extraem apenas através de moléculas livres, e simplesmente não interagem com uma fração vinculada do analito. A biocompatibilidade dos revestimentos não introduz toxicidade ao tecido ao mesmo tempo em que restringe a extração de moléculas grandes, como proteínas; como consequência, os processos enzimáticos já são inibidos na fase de coleta de amostras e a presença de artefatos é minimizada, o que é uma grande vantagem sobre métodos alternativos de amostragem. O comprimento do revestimento influencia a eficiência da extração (ou seja, o comprimento do revestimento designa a área da superfície e o volume da fase de extração); assim, revestimentos mais longos produzem recuperações mais altas. Por outro lado, revestimentos mais curtos permitem maior resolução espacial. Para resultados confiáveis, é crucial submergir a sonda na mesma profundidade do córtex renal. A inserção muito profunda causa o risco de entrar na medula renal. O tempo de extração também é proporcional à eficiência de extração. Portanto, a seleção do tempo ideal de extração é um dos passos mais críticos no desenvolvimento do método SPME. A precisão da medição do tempo proporciona a maior repetibilidade. Em aplicações biológicas como a discutida, há sempre um compromisso entre a sensibilidade e a repetibilidade do protocolo analítico e as restrições do procedimento médico. Embora a extração do equilíbrio forneça a maior sensibilidade, por razões de segurança, as condições de pré-equilíbrio são frequentemente utilizadas em tais aplicações, já que o tempo de extração não deve afetar a duração total da cirurgia. A eficiência da desorção é determinada pelo tempo do processo e pela composição do solvente de desorção, que deve ser compatível com a fase móvel utilizada para separação cromatográfica^9,,10,,11.

Um dos principais requisitos para instrumentação diagnóstica utilizado para avaliações intracirúrgica é o tempo de análise. As tentativas atuais estão sendo feitas para desenvolver uma ferramenta rápida para extração in vivo SPME acoplada diretamente a um espectrômetro de massa através de interface aberta microfluida (MOI)²⁴ ou spray de lâmina revestida (CBS)²⁵. Tais abordagens permitiriam a divulgação de resultados analíticos em tempo real ou próximo. O uso desses métodos para análises pré-intervenção de perfis metabólicos e lipidómicos poderia potencializar o processo de tomada de decisão durante os procedimentos de transplante, possibilitando a melhor abordagem personalizada possível e resposta rápida em caso de falência de órgãos.

Como resumo, é supor que o protocolo proposto permitirá a obtenção de perfis metabólicos e lipidómicos completos de enxertos renais, o que, por sua vez, proporcionaria uma avaliação abrangente da qualidade dos órgãos e da caracterização dos processos responsáveis pela lesão isquemia-reperfusão. A novidade do projeto inclui a utilização da microextração em fase sólida (SPME), oferecendo baixa amostragem invasiva de sistemas vivos, em combinação com uma das tecnologias mais inovadoras disponíveis para metabolômica e análise lipidóica (por exemplo, o espectrômetro de massa de alta resolução orbitrap). O SPME combina coleta, extração e sacieçação de metabólitos em uma etapa, tornando-a uma ferramenta perfeita para análise rápida. Espera-se que este protocolo ajude a responder perguntas relacionadas às condições pré-transplante do rim responsáveis pela demora na função do órgão ou suas disfunções após o transplante, bem como como o protocolo de preservação do enxerto influencia a bioquímica do órgão. Tal conhecimento não só teria impacto significativo na prevenção de possíveis complicações relacionadas ao transplante, mas poderia ajudar a melhorar os protocolos atuais de preservação do enxerto, minimizando a perda de tecido transplantado viável, bem como a perda de vidas. A solução proposta abrirá as portas para investigações posteriores neste campo, incluindo a validação de potenciais biomarcadores específicos e a melhoria dos desfechos terapêuticos em transplantologia.