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Biologie

Identificazione sul campo della camomillia Matricaria utilizzando un sistema qPCR portatile

Published: October 10, 2020
doi:
10.3791/60940
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1Herbalife NatSource (Hunan) Natural Products Co., Ltd., 2Corporate Quality Laboratory,Herbalife International of America, Inc., 3Corporate Quality,Herbalife International of America, Inc., 4Hyris Ltd, 5Natural Health Product Research Alliance,University of Guelph

Summary

Presentato qui è un protocollo per l’identificazione sul campo della camomillia Matricaria utilizzando un sistema qPCR portatile. Questo protocollo facile da eseguire è ideale come metodo per confermare l’identità di una specie botanica in luoghi in cui l’accesso alle attrezzature e alle competenze di laboratorio è limitato, come aziende agricole e magazzini.

Abstract

Il controllo di qualità nei prodotti botanici inizia con l’approvvigionamento di materie prime. Tradizionalmente, l’identificazione botanica viene eseguita attraverso la valutazione morfologica e i metodi analitici chimici. Tuttavia, la mancanza di disponibilità dei botanici, soprattutto negli ultimi anni, unita alla necessità di migliorare il controllo di qualità per combattere gli stress sulla catena di approvvigionamento, causata dall’aumento della domanda dei consumatori e dei cambiamenti climatici, richiede approcci alternativi. L’obiettivo di questo protocollo è facilitare l’identificazione delle specie botaniche utilizzando un sistema qPCR portatile sul campo o in qualsiasi ambiente, in cui l’accesso alle attrezzature e alle competenze di laboratorio sia limitato. Il DNA bersaglio viene amplificato utilizzando il qPCR a base di colorante, con il DNA estratto da materiali di riferimento botanici che funge da controllo positivo. Il DNA bersaglio è identificato dalla sua amplificazione specifica e abbina il suo picco di fusione con il controllo positivo. È stata inclusa una descrizione dettagliata dei passaggi e dei parametri, dalla raccolta di campioni di campo pratico, all’estrazione del DNA, all’amplificazione PCR, seguita dall’interpretazione dei dati, per garantire che i lettori possano replicare questo protocollo. I risultati prodotti si allineano con i metodi di identificazione botanica tradizionali di laboratorio. Il protocollo è facile da eseguire e conveniente, consentendo test di qualità sulle materie prime il più vicino possibile al punto di origine della catena di approvvigionamento.

Introduction

La pratica di utilizzare botanici per mantenere e migliorare la salute risale a migliaia di anni. A causa delle sollecitazioni sulla filiera portate dall’aumento della domanda dei consumatori1, pratiche di raccolta insostenibili e cambiamenticlimatici 2, l’adulterazione botanica sta diventando una preoccupazione crescente nell’industria alimentare e degli integratorialimentari 3. La presenza di specie botaniche non dichiarate o non identificate in modo improprio può portare a una riduzione dell’efficacia o addirittura a problemi di sicurezza. Ad esempio, il cohosh nero (Actaea racemosa), utilizzato per il trattamento del disagio premestruale, può essere sostituito con una specie asiatica a basso prezzo con un supporto limitato di dati clinici per la suaefficacia 4. In un caso più grave, la sostituzione di Aristolochia fangchi per Stephania terandra in uno studio clinico per la perdita di peso utilizzando erbe cinesi ha portato a grave nefrotossicità e insufficienza renale in alcuni partecipanti5,6. Le due diverse specie condividevano un nome comune cinese “Fang Ji”. Questi casi evidenziano la necessità di un controllo di qualità più rigoroso, a partire dall’identificazione delle materie prime7, preferibilmente il più vicino possibile al punto di origine della catena di approvvigionamento, in modo che le risorse possano essere allocate in modo efficiente al materiale di corretta identità.

Un certo numero di approcci ortogonali può essere utilizzato per l’identificazione botanica. Tradizionalmente, l’identificazione botanica viene eseguita attraverso la valutazionemorfologica 8,9 e i metodi analitici chimici10,11,12,13. L’identificazione morfologica si basa sulle differenze nelle caratteristiche macroscopiche e microscopiche dei materiali vegetali se esistono differenze (Figura 1). Tuttavia, la mancanza di programmi di formazione sulla botanica classica negli ultimi anni ha provocato una carenza di esperti14, rendendo questo approccio impraticabile per il controllo di qualità di routine. La sua applicazione in materiali botanici in polvere è anche limitata. I metodi analitici chimici sono ampiamente utilizzati in farmacia e laboratori, ma non sono ideali per i test sul campo a causa delle dimensioni di strumenti come la cromatografia a strato sottile ad alte prestazioni (HPTLC), la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR)(Figura 2)e i requisiti dell’ambiente. Recentemente, i metodi genomici sono emersi come una tecnica alternativa per l’autenticazione e il rilevamento della sostituzione delle specie botaniche e si sono dimostrati efficienti e precisi. I metodi genomici sfruttano l’alta fedeltà e specificità delle informazioni genetiche nei materialivegetali 15,16,17,18,19. Gli strumenti di diagnostica molecolare sono disponibili sotto forma di dispositivi portatili e spesso includono strumenti automatizzati di interpretazione dei dati che abbassano la barriera all’uso della tecnologia, rendendo questo approccio ideale perl’identificazione sul campo 20,21,22,23,24. Una volta che il metodo di analisi molecolareè stato progettato e convalidato 25,26,27, può essere eseguito da qualsiasi personale con formazione di biologia molecolare di base. Tra i diversi strumenti portatili disponibili, PCR in tempo reale su sequenze di DNA è una delle scelte convenienti28. La combinazione di un dispositivo portatile, insieme all’analisi molecolare personalizzata e convalidata, consente la verifica di specie e ingredienti botanici al di fuori del laboratorio, come nelle aziende agricole e nei magazzini di materiale botanico, riducendo i tempi e i costi associati ai metodi tradizionali.

L’obiettivo di questo protocollo è quello di introdurre un metodo per l’identificazione botanica in situazioni in cui l’accesso alle attrezzature e alle competenze di laboratorio è limitato o non disponibile, utilizzando un sistema qPCR portatile. Il metodo è dimostrato su un campo di matricaria cammomilla (Figura 3A), comunemente noto come camomilla tedesca, ampiamente utilizzato per le sue proprietà antinfiammatoriee antiossidanti 29. Può essere confuso con specie correlate di aspetto o odore simile, in particolare dai generi Chamaemelum, Tanacetume Chrysanthemum30,31,32. Tra le specie correlate, Chamaemelum nobile, noto anche come camomilla romana, è evidente con livelli di produzione comparabili nel commercio (Figura 3B). Il metodo dimostrato è stato progettato non solo per identificare la specie botanica bersaglio M. cammomilla, ma anche rilevare il suo parente stretto, C. nobile, sulla base di amplificazione specifica delle sequenze di DNA.

Questo articolo spiega, in dettaglio, come eseguire l’identificazione botanica sul campo di M. cammomilla utilizzando l’analisi qPCR a base di colorante intercalante e curva di fusione su un dispositivo portatile. Il protocollo include la raccolta di campioni botanici dal campo, l’estrazione del DNA in loco e la configurazione della reazione PCR in tempo reale. Per garantire una conclusione valida, come controllo positivo vengono utilizzati il DNA genomico botanico M. cammomilla e il DNA genomico C. nobile botanico non bersaglio, pre-estratto da materiali di riferimento botanici certificati. La specificità di questo metodo è dimostrata eseguendo sia M. cammomilla che C. nobile test di identificazione singolarmente su campioni e controlli. Il controllo negativo non modello viene utilizzato per escludere i risultati falsi positivi causati dalla contaminazione da PCR.

Protocol

1. Raccolta di campioni Impostare un’area di prova sul campo con una superficie piana e orizzontale. Identificare una pianta rappresentativa che rifletta le caratteristiche della maggior parte delle piante nel campo dei fiori di camomilla (Figura 4). Raccogliere una testa di fiore dalla pianta rappresentativa con guanti sterili. Collocare il campione in un tubo di raccolta di 2,0 mL. Ripetere i passaggi da 1,3 a 1,4 e raccogliere un volantino (circa 0,5–0,7 cm di lunghezza) dallo stesso impianto.NOTA: M. chamomilla fiore e foglia sono abbastanza piccoli per sedersi sul fondo di un tubo di raccolta di 2,0 mL. Per altri prodotti botanici con superficie più ampia, un punzone di carta o forbici (risciacquato nel 70% di etanolo prima dell’uso) può essere utilizzato per isolare campioni di tessuto per il test. Quando è richiesto il campionamento multiplo, sciacquare il punzone di carta o le forbici tra la manipolazione di campioni diversi. 2. Estrazione del DNA Preriscaldare l’incubatrice del bagno asciutto a 95 gradi centigradi. Per ogni tubo di raccolta, aggiungere 100 L della soluzione di estrazione dal kit di estrazione del DNA vegetale (elencato nella Tabella dei Materiali). Per una migliore efficienza di estrazione del DNA, macinare il campione di tessuto nella soluzione di estrazione utilizzando un pestello di tessuto. Chiudi il tubo. Assicurarsi che il tessuto botanico sia coperto con la soluzione di estrazione durante tutto il processo di estrazione. Collocare i tubi di raccolta in un’incubatrice a secco preriscaldata e incubare i tubi di raccolta a 95 gradi centigradi per 10 minuti. Dopo 10 minuti, togliere i tubi dall’incubatrice del bagno asciutto. Aggiungere 100 L della soluzione di diluizione dallo stesso kit di estrazione del DNA e mescolare la soluzione pipettando su e giù più volte. Ripetere lo stesso passaggio per l’estrazione del volantino. Agitare ulteriormente per mescolare ulteriormente la soluzione. Il tessuto vegetale di solito non sembra essere degradato dopo questo trattamento. Il colore liquido può cambiare e diventare nuvoloso.NOTA: La soluzione diluita può essere conservata a temperatura ambiente durante la notte se non procede immediatamente. Non è necessario rimuovere i detriti cellulari dal tessuto vegetale prima dello stoccaggio. Il liquido nei tubi contiene i modelli di DNA per l’amplificazione PCR a valle. 3. Configurazione della reazione PCR Configurare le condizioni di termociclismo dello strumento qPCR in base alle specifiche del produttore. Applicare il profilo termociclico PCR elencato nella Tabella1, che inizia con un passaggio di temperatura costante per la denaturazione iniziale, seguito da 25 cicli di amplificazione, e termina con la rampa di temperatura per ottenere una curva di fusione ad alta risoluzione. Scongelare il qPCR Master Mix e i primer (Tabella 2) a temperatura ambiente prima dell’uso. Pianificare la reazione che verrà caricata in ogni pozzo: pozzi contenenti controllo positivo con specie bersaglio, controllo positivo con specie non bersaglio, campioni e controllo negativo (Figura 5). In questo esempio vengono utilizzati dieci pozzi: cinque per il test di identificazione della camomilla tedesca e i restanti cinque per il test di identificazione della camomilla romana. Per ogni tipo di test di identificazione delle specie, un pozzo contiene un controllo positivo con il DNA estratto dal materiale di riferimento delle specie bersaglio, uno contiene un controllo positivo con il DNA estratto dal materiale di riferimento delle specie non mirate, due pozzi sono riempiti con campioni di DNA di fiori e foglie estratti dal campo e uno è assegnato per un controllo negativo. La tabella 3 descrive ogni tipo di pozzo. Preparare un master-mix di reazione secondo il manuale per ogni test di identificazione delle specie botaniche. Un tipico master-mix di reazione contiene qPCR Master Mix universale (2x), primer specifici delle specie in avanti e inversa e acqua senza nuclease. La tabella 4 elenca la composizione del sistema di reazione.NOTA: Se non si utilizza immediatamente, conservare il master-mix di reazione qPCR a 2 gradi centigradi in un dispositivo di raffreddamento o mini-frigo. Mescolare accuratamente il master-mix di reazione pipettando prima dell’uso. Posizionare la cartuccia qPCR a faccia in su su su una superficie piana e stabile. Caricare 18 L del mix principale di reazione configurato nel passaggio 3.4 nei pozzetti della cartuccia in base ai pozzetti definiti al punto 3.3. Per questa dimostrazione, aggiungere il mix master di reazione di reazione test di identificazione della camomilla tedesca in pozzi etichettati per il test GC (GCT nei pozzi 1, 3, 5, 7, 9) e il test di identificazione della camomilla romana reazione master-mix in pozzi etichettati per il test RC (RCT nei pozzi 2, 4, 6, 8, 10) (vedere Figura 5). Trasferire 2 L del DNA campione dal supernante dei tubi di estrazione del DNA e dai controlli positivi del DNA pre-estratti in pozzi di cartuccia precaricati con mix master qPCR. Dopo aver aggiunto ogni modello di DNA al mix master qPCR, mescolare delicatamente la soluzione pipettando.NOTA: Evitare di galleggiare detriti cellulari durante il trasferimento del DNA dal tubo di estrazione del DNA. Utilizzare minicentrifuge per separare i detriti supernatant e cellulari, se necessario. Sigillare con cura la cartuccia con pellicola adesivo. Caricare la cartuccia sulla camera termociclica e chiuderla. Impostare lo strumento qPCR per l’esecuzione.

Representative Results

Seguendo il protocollo descritto nella sezione 1, il DNA botanico dalla testa e dalla foglia dei fiori sono stati estratti nel supernante dopo l’incubazione termica del tubo di raccolta a 95 gradi centigradi per 10 minuti. Nello studio attuale, il supernatanto ha mostrato un colore giallo e verdastro sia per il fiore che per la foglia, indicando che una varietà di composti naturali sono stati rilasciati nel supernatant con DNA botanico (Figura 6). Sebbene l’amplificazione PCR affidabile sia stata ottenuta più tardi in triplicato per tutti i modelli di DNA estratti sul campo, la valutazione della qualità del DNA è stata eseguita in laboratorio come riferimento. La concentrazione dell’estratto di DNA della testa di fiore, determinata dalla fluorometria, variava da 3,69–5,36 ng/L, mentre la concentrazione dell’estratto di DNA foglia variava da 6,42–9,29 ng/L. I rapporti di assorbimento A260/A280 e A260/A230 di estratti di DNA di fiori e foglie sono stati misurati mediante spettrofotometria. Tuttavia, a causa della sovrapposizione tra DNA e spettro di assorbimento UV fitochimico, questi rapporti non potevano essere misurati in modo affidabile (dati non mostrati). L’intercalazione del colorante fluorescente è stata utilizzata per monitorare l’amplificazione dei frammenti bersaglio in tempo reale. Dal momento che entrambi i primir specifici M. cammomilla e C. nobile prendono di mira la regione interna trascritta distanziale 2 (ITS2), che ha da decine a centinaia di copie nel genoma della pianta, 25 cicli di amplificazione PCR sono sufficienti a generare abbastanza ampliconi per l’identificazione delle specie di camomilla. Nella Figura 7, il valore Ct per il controllo positivo di M. cammomilla nel test di identificazione M. cammomilla era inferiore a 25 (GCP_GCT), mentre dopo 25 cicli di amplificazione, la fluorescenza dello stesso controllo nel test di identificazione C. nobile era al di sotto della soglia di rilevamento (GCP_RCT). D’altra parte, dopo 25 cicli, la fluorescenza per il controllo positivo C. nobile nel test di identificazione M. cammomilla era al di sotto della soglia di rilevamento (RCP_GCT), mentre il valore Ct per lo stesso controllo nel test di identificazione C. nobile era inferiore a 25 (RCP_RCT). L’amplificazione dei controlli positivi bersaglio e non bersaglio nei rispettivi saggi dimostra la specificità del saggio di identificazione M. cammomilla. Per il DNA campione, la testa di fiore di campo e l’estratto di DNA foglia hanno prodotto valori Ct di 15,18 e 19,41 nel test di identificazione della camomillia M., rispettivamente (Sample1(FLOWER)_GCT e Sample2(LEAF)_GCT). Entrambi questi campioni non sono stati amplificati nel test di identificazione C. nobile (Esempio1(FLOWER)_RCT e Sample2(LEAF)_RCT). I modelli di amplificazione di entrambi i campioni corrispondevano al modello di amplificazione del controllo positivo di M. cammomilla. I controlli negativi non sono stati amplificati sia nei test di identificazione M. cammomilla che C. nobile (NC_GCT e NC_RCT), escludendo la possibilità di falsi positivi causati dalla contaminazione da PCR. Per confermare ulteriormente l’amplificazione specifica nei controlli positivi e nei campioni, le frazioni del prodotto finale PCR di ciascun pozzo sono state eseguite su gel di agarose del 2% in laboratorio (Figura 8). Per il test di identificazione M. cammomilla, entrambi i campioni di campo hanno prodotto ampliconi in esecuzione nella stessa posizione del controllo positivo M. cammomilla con una dimensione stimata leggermente superiore a 100 bp (dimensione teorica 102 bp). Per il test di identificazione C. nobile, il controllo positivo delle specie non bersaglio C. nobile ha prodotto una banda compresa tra 50 e 100 bp, con una dimensione teorica di 65 bp. Il resto delle corsie non ha mostrato alcun prodotto di amplificazione specifico, che era in accordo con l’assenza di segnale fluorescente per questi pozzi, come osservato nei test sul campo. A seguito dell’amplificazione PCR, è stata eseguita un’analisi della curva di fusione per valutare le caratteristiche di dissociazione del DNA a doppio filamento (dsDNA) durante il riscaldamento. Quando la temperatura è dilazionata durante il ciclo finale per l’analisi della curva di fusione, l’aumento della temperatura ha causato la dissociarsi degli ampliconi a doppio filo. Il colorante fluorescente intercalante è stato gradualmente rilasciato nella soluzione, diminuendo l’intensità della fluorescenza (Figura 9A). Il punto di flessione della prima curva derivata è stato utilizzato per determinare la temperatura di fusione (Tm) (Figura 9B), che dipende principalmente dalla lunghezza del frammento di DNA e dal contenuto GC. La combinazione del valore Ct con la temperatura di fusione può aumentare la specificità dell’analisi qPCR. Nello studio attuale, il picco della temperatura di fusione di M. camomillia controllo positivo PCR amplicon si è verificato a 85,6 gradi centigradi (GCP_GCT) ed è stato distinto dal picco di temperatura di fusione di C. nobile controllo positivo PCR amplicon a 79,1 gradi C (RCP_RCT). L’amplicon PCR della testa di fiore di campo e della foglia ha prodotto picchi di temperatura di fusione rispettivamente a 85,2 gradi centigradi e 84,8 gradi centigradi (Sample1(FLOWER)_GCT e Sample2(LEAF)_GCT). Per valutare le variazioni di temperatura di fusione misurate dal sistema portatile qPCR, sono stati raccolti ulteriori punti dati per confermare che le temperature di fusione del campione erano sempre vicine alla temperatura di fusione ottenuta dal controllo positivo di M. cammomilla (entro 2 gradi centigradi) ed erano lontane dalla temperatura di fusione dell’amplificatore di controllo positivo C. nobile ( Figura10). I picchi di temperatura di fusione sono stati talvolta segnalati in altri pozzi. Tuttavia, i loro valori di Ct non erano inferiori a 25 e i picchi di temperatura di fusione non erano vicini al controllo positivo di M. camomillia o C. nobile (più di 2 gradi centigradi a parte). In sintesi, il campo M. chamomilla test di identificazione può essere interpretato in base alle regole decisionali riepilogate nella tabella 5. Con tutti i controlli positivi positivi per la specie botanica putativa, negativi per le altre specie, e controlli negativi che testano negativo, entrambi i campioni di campo sono stati determinati per contenere M. camomillia ma non C. nobile. Inoltre, per allineare i risultati dei test sul campo con altre tecniche analitiche, le conclusioni sul campo sono state ulteriormente confermate da un metodo di codice a barre del DNAconvalidato in precedenza 25 (dati non mostrati). Figura 1: Identificazione morfologica dei materiali botanici. (A) Fiori di Hibiscus rosa-sinensis, radici di Curcuma longa, foglie di Malva Sylvestris, foglie di Rosmarinus officinalis, semi di sativum di Coriandrum, radici officinale. (B) Petroselinum crispum e Apium graveolens fiocchi sono difficili da differenziare. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Identificazione chimica dei materiali botanici. (A) strumento HPTLC e un cromatogramma HPTLC rappresentativo. (B) strumento HPLC e un cromatogramma HPLC rappresentativo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Matricaria camomilla e Chamaemelum nobile in campo. (A) Matricaria cammomilla, adattato da Wikipedia sotto CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg. (B) Chamaemelum nobile, adattato da Wikipedia sotto CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Raccolta di parti di piante M. camomilla dal campo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Layout dei pozzetti di test nella dimostrazione. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Estratto di DNA di campo nei tubi di raccolta. Il tessuto botanico rimane nel tubo originale ed è coperto da un estratto di DNA giallastro. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Grafico della fluorescenza che mostra l’accumulo di prodotti PCR su 25 cicli di termociclismo. M. chamomilla controllo positivo e C. nobile controllo positivo mostrano valori Ct inferiori a 25 nei test di identificazione M. camomilla e C. nobile, rispettivamente. I campioni di fiori e foglie sul campo sono stati amplificati dal test di identificazione M. cammomilla con valori Ct di 15,18 e 19,41. Il resto dei pozzi non sono stati amplificati. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8: Elettroforesi gel dei prodotti di amplificazione PCR sul campo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 9: Analisi della temperatura di fusione. (A) Il segnale di fluorescenza in ogni pozzo diminuisce con l’aumento della temperatura. (B) L’identità dei prodotti PCR è stata confermata dal picco della temperatura di fusione nell’analisi della curva di fusione. I campioni di fiori e foglie di campo mostrano picchi di 85,2 gradi centigradi e 84,8 gradi centigradi. Questi sono vicini al picco prodotto da M. controllo positivo camomillia. Il controllo positivo di C. nobile ha prodotto un picco di 79,1 gradi centigradi, che è diverso dagli altri tre campioni. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 10: Fusione della variazione del picco di temperatura tra il controllo positivo e i campioni di campo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Palco Ciclo Temperatura Ore Temperatura costante 1 95 gradi centigradi 60s Amplificazione 25 95 gradi centigradi 30s 60 gradi centigradi 30s Curva di fusione 1 60 gradi centigradi Rampa 0,05 gradi centigradi 95 gradi centigradi Tabella 1: condizioni di termociclismo qPCR per i test di identificazione di M. cammomilla e C. nobile. Saggio Nome primer Sequenza 5′-3′ Posizione Regione Dimensione amplicon Matricaria recutita N. di file TCGTCGGTCGCAAGGATAAG Avanti IL SUO2 102 bp N. 4 TAAACTCAGCGGGTAGTCCC Invertire Chamaemelum nobile L11 TGTCGCACGTTGCTAGGAAGCA Avanti IL SUO2 65 bp L12 TCGAAGCGTCATCCTAAGACAAC Invertire Tabella 2: Primer coppie per M. camomilla e C. nobile test di identificazione. Posizione bene Nome bene Descrizione 1 GC_PosCtrl_GC_Test Controllo positivo della camomilla tedesca sotto il test GC 2 GC_PosCtrl_RC_Test Controllo positivo della camomilla tedesca sotto RC Test 3 RC_PosCtrl_GC_Test Controllo positivo camomilla romana sotto GC Test 4 RC_PosCtrl_RC_Test Controllo positivo camomilla romana sotto RC Test 5 Field_Sample_GC_Test Campione di tessuto fogliare sotto test GC 6 Field_Sample_RC_Test Campione di tessuto fogliare in fase di test RC 7 Field_Sample_GC_Test Campione di tessuto floreale sotto test GC 8 Field_Sample_RC_Test Campione di tessuto floreale in fase di test RC 9 NegCtrl_GC_Test Campione di controllo negativo nel test GC 10 NegCtrl_RC_Test Campione di controllo negativo in RC Test Tabella 3: Tipi e descrizioni dei tipi di pozzo per i test di identificazione di M. camomilla e C. nobile. Reagente GC_Test RC_Test Combinazione qPCR universale 10 L 10 L Primer L3 (10 M) 0,4 L Na Primer N4 (10 M) 0,4 L Na Primer 11 USD (10 M) Na 0,4 L Primer 12 USD (10 M) Na 0,4 L H2O (Senza Nuclease) 7,2 L 7,2 L – contiene Hot Start Taq DNA Polymerase Tabella 4: Composizione Master-mix per prove di identificazione M. cammomilla e C. nobile. Nome bene Risultato previsto Criteri di risultato positivo Criteri di risultato negativo Rilevato / Presente Non rilevato / Assente GC_PosCtrl_GC_Test Rilevato Ct < 25 e 84 < Tm < – GC_PosCtrl_RC_Test Non rilevato – Nessun valore Ct entro 25 cicli RC_PosCtrl_GC_Test Non rilevato – Nessun valore Ct entro 25 cicli RC_PosCtrl_RC_Test Rilevato Ct < 25 e 79 < Tm < – Field_Sample_Leaf_GC_Test Presente Ct < 25 e 84 < Tm < Nessun valore Ct entro 25 cicli Field_Sample_Leaf_RC_Test Assente – Nessun valore Ct entro 25 cicli Field_Sample_Flower_GC_Test Presente Ct < 25 e 84 < Tm < Nessun valore Ct entro 25 cicli Field_Sample_Flower_RC_Test Assente – Nessun valore Ct entro 25 cicli NegCtrl_GC_Test Non rilevato – Nessun valore Ct entro 25 cicli NegCtrl_RC_Test Non rilevato – Nessun valore Ct entro 25 cicli Tabella 5: Regole per l’interpretazione dei risultati qPCR.

Discussion

La progettazione dei primer e la selezione dei modelli sono i passaggi cruciali per ottenere un’amplificazione qPCR efficiente e specifica. Dopo aver identificato un modello adatto, il software di progettazione primer viene in genere utilizzato per facilitare la selezione dei primer in base a variabili di progettazione quali la lunghezza del primer, la temperatura di fusione e il contenuto GC33,34. L’ottimizzazione e la convalida possono essere eseguite nelle condizioni sperimentali previste del saggio per garantire specificità, sensibilità e robustezza di una reazione PCR35. La progettazione di primer non ottimale può provocare la formazione di primer-dimer, in cui le interazioni primer producono prodotti non specifici36.

I controlli no template (NTC) utilizzati in questo studio controllano sia la contaminazione del DNA che la presenza di primer-dimer che potrebbero influenzare il saggio. I risultati non hanno mostrato amplificazione, una buona indicazione che sia la contaminazione del DNA che i primer-dimer non sono una preoccupazione. La contaminazione del DNA e i primi-dimer si manifestano in curve di fusione senza controlli di modello e come picchi extra nelle curve di fusione dei controlli positivi. In genere, la curva di fusione di un controllo positivo dovrebbe contenere un singolo picco, a meno che i sottodomini ricchi di AT nel modello non causino una fusione non uniforme. I doppi picchi potrebbero essere previsti simulando i saggi di fusione utilizzando il software uMELT37. In questo studio, il gold standard di esecuzione del prodotto PCR su gel di agarose è stato utilizzato per confermare la presenza di prodotto PCR di destinazione e l’assenza di contaminazione e primer-dimers.

Una notevole sfida nell’analisi molecolare dei materiali botanici è l’ottenimento di DNA di buona qualità dopo il processo di estrazione del DNA botanico. Materiali botanici sono scambiati e consumati per i composti chimici attivi che sono associati con benefici per la salute. Nel processo di estrazione del DNA, questi composti chimici saranno anche rilasciati nella soluzione di estrazione del DNA, causando potenzialmente l’inibizione della PCR, causando così guasti nell’amplificazione PCR. Sono stati sviluppati vari kit di purificazione del DNA vegetale utilizzando solventi organici e colonne per rimuovere i composti chimici derivati dai prodotti botanici38. Tuttavia, il cofano fume e la centrifuga ad alta velocità necessari per assistere questi kit non sono disponibili sul campo.

Nell’attuale protocollo, il metodo semplificato di estrazione del DNA utilizza un kit commerciale di estrazione del DNA delle piante (vedere Tabella dei materiali per i dettagli). Aveva la capacità di neutralizzare le sostanze inibitorie comuni per risultati riproducibili e ha prodotto risultati coerenti per M. camomillia e C. nobile. Sia M. cammomilla che C. nobile fioriscono teste e foglie hanno prodotto amplificatori PCR con picchi di fusione specifici, indicando che la presenza di inibitori PCR non era una preoccupazione. Per altre piante con livelli più elevati di inibitori PCR, amplificare il DNA nella loro estrazione originale può essere meno efficiente. Per ridurre l’inibizione e migliorare l’efficienza di amplificazione, con accesso all’intera pianta, altre parti dell’impianto con basso contenuto di polisacrica e polifenolo possono essere utilizzate anche per scopi di identificazione. Se c’è un accesso limitato a diverse parti della pianta, foglie più giovani o petali sezionati da teste di fiori, che in genere hanno un contenuto fenolicoinferiore 39, può offrire una migliore possibilità di successo. Poiché le sequenze di DNA sono coerenti nell’intera pianta, qualsiasi parte della pianta può essere utilizzata per confermare l’identità delle specie. Se l’amplificazione PCR è ancora non ottimale, l’estratto di DNA originale può essere ulteriormente diluito prima della PCR, o possono essere utilizzati protocolli di purificazione di laboratorio più sofisticati.

Un’altra sfida per l’analisi PCR sono i risultati falsi positivi causati dalla contaminazione del DNA, che può avere un impatto negativo sull’interpretazione dei dati. Di solito è controllato da pulizie attive, utilizzando attrezzature dedicate e limitando il lavoro alle aree designate. Utilizzando qPCR, tutte le analisi PCR possono essere eseguite in un sistema chiuso, il che riduce notevolmente la possibilità di contaminazione da amplificatori PCR in un ambiente non ben controllato. Inoltre, il DNA ambientale non dovrebbe anche mostrare un falso positivo a causa della specificità del saggio, secondo un precedente studio di convalida40.

C’è spazio per miglioramenti. Nel protocollo qui presentato, il colorante intercalante è stato utilizzato per mostrare l’amplificazione del frammento di bersaglio in tempo reale. La specificità del metodo è ulteriormente confermata dalla caratteristica temperatura di fusione, che si distingue tra gli ampliconi M. camomilla e C. nobile. Pertanto, l’intercalazione pcR basata sulla colorante può rispondere in modo efficiente alla domanda “Cos’è questa specie vegetale?” nel campo. Tuttavia, oltre alla necessità di eseguire l’identificazione botanica su una singola pianta isolata dal campo, in molte circostanze, polveri botaniche o estratti nel magazzino beneficeranno anche di una rapida valutazione dell’identità in loco. Per questi tipi di materiali, potrebbe essere necessario affrontare ulteriori domande, come “Cosa c’è in questo materiale?”, “Contiene le specie botaniche che sto cercando?”, “Contiene adulteranti che voglio evitare?” e “È sostituito interamente o parzialmente da altre specie botaniche che sono dannose?”. Invece di utilizzare coloranti intercalanti, diverse sonde qPCR possono essere progettate per indirizzare ampliconi provenienti da diversi prodotti botanici in un unico sistema di reazione, mantenendo alta specificità ed efficienza del saggio. Lo sviluppo di qPCR basato su probe e l’utilizzo di un sistema qPCR portatile che offre il rilevamento di più canali possono estendere ulteriormente l’applicazione dei test sul campo come analisi adatta allo scopo a un ambiente più ampio, come magazzini di materiali botanici e centri di distribuzione per rispondere a domande più complesse. Inoltre, l’utilizzo di più sonde consente inoltre all’utente di includere l’amplificazione interna in ogni sistema di reazione, in modo che siano disponibili ulteriori informazioni quando si sospetta l’inibizione della PCR.

Il protocollo qui presentato presenta i seguenti vantaggi rispetto alle tecnologie esistenti utilizzate per lo stesso scopo. In primo luogo, per i metodi di identificazione morfologica e chimica tradizionali, la procedura e i suoi risultati devono essere condotti e interpretati da esperti. I test di identificazione basati su qPCR possono essere condotti da persone con formazione di biologia molecolare di base e interpretati in modo più standardizzato. In secondo luogo, rispetto all’identificazione e alla differenziazione delle specie basate su qPCR normalmente eseguite in laboratorio, il protocollo di identificazione sul campo che utilizza uno strumento portatile non richiede strumenti con un ingombro elevato, come una centrifuga ad alta velocità, apparecchiature di valutazione della qualità del DNA, ciclo termico con rilevatore di fluorescenza e un computer che esegue un software speciale. Pertanto, l’identificazione delle specie basate sul DNA può essere eseguita senza indugio in qualsiasi ambiente. In terzo luogo, la ricerca di materiali botanici è un compito che richiede un’operazione globale. Con i progressi nei servizi cloud e nell’intelligenza artificiale, un dispositivo portatile può potenzialmente ricevere metodi sviluppati e convalidati da esperti in laboratorio, essere gestito da non esperti in aree remote e produrre certificazioni oggettive da terze parti. Pertanto, questa opzione è più convincente che mai con il lavoro remoto diventando la tendenza.

In sintesi, il protocollo qui ha dimostrato l’identificazione sul campo di M. camomilla utilizzando un sistema portatile qPCR. Il successo dell’applicazione di questa tecnica genererà risultati altamente accurati sull’identificazione botanica e aiuterà i produttori e i fornitori botanici a qualificare i materiali botanici in modo tempestivo ed economico.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo James Shan per i suoi sforzi nella registrazione video sul campo. Ringraziamo Jon Byron e Matthew Semerau per il loro lavoro nell’editing video. Ringraziamo Ansen Luo, Harry Du e Frank Deng per il loro sostegno nell’individuazione del campo di prova. Ringraziamo Maria Rubinsky per i suoi preziosi commenti sull’intero manoscritto. Tutte le persone riconosciute sono dipendenti di Herbalife International of America, Inc.

Materials

Battery TNE 78000mAh Provide field power supply
bCUBE HYRIS bCUBE 2.0 Portable qPCR instrument
Cartridges(16 Well) HYRIS NA Consumables for bCUBE
Electric pipette Eppendorf NA Handling liquid
Extract-N-AmpTM plant PCR kit SIGMA XNAP2-1KT Plant DNA extraction kit
German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials AHP 2264 Used as positive control
Mini dry bath Yooning MiniH-100L For DNA extraction
Nuclease-free water AMBION AM9937 qPCR reaction
Primer Thermo Fisher Scientific NA qPCR reaction
Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials ChromaDex ASB-00030806-005 Used as positive control
Luna universal qPCR master mix NEB M3003L qPCR reaction
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Citer Cet Article
Yang, Z., Quan, Z., Chua, T., Li, L., Zhang, Y., Babajanian, S., Buongiorno, F., Noce, I. D., Colombo, L., Newmaster, S., Chua, T., Chang, P., Swanson, G., Lu, Z. Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System. J. Vis. Exp. (164), e60940, doi:10.3791/60940 (2020).
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