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Biologie

Identification sur le terrain de Matricaria chamomilla à l’aide d’un système qPCR portable

Published: October 10, 2020
doi:
10.3791/60940
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1Herbalife NatSource (Hunan) Natural Products Co., Ltd., 2Corporate Quality Laboratory,Herbalife International of America, Inc., 3Corporate Quality,Herbalife International of America, Inc., 4Hyris Ltd, 5Natural Health Product Research Alliance,University of Guelph

Summary

Présenté ici est un protocole pour l’identification sur le terrain de Matricaria chamomilla à l’aide d’un système qPCR portable. Ce protocole facile à exécuter est idéal pour confirmer l’identité d’une espèce botanique à des endroits où l’accès à l’équipement et à l’expertise de laboratoire est limité, comme les fermes et les entrepôts.

Abstract

Le contrôle de la qualité des produits botaniques commence par l’approvisionnement en matières premières. Traditionnellement, l’identification botanique est effectuée par l’évaluation morphologique et les méthodes d’analyse chimique. Toutefois, le manque de disponibilité des botanistes, en particulier ces dernières années, associé à la nécessité d’améliorer le contrôle de la qualité pour lutter contre les contraintes sur la chaîne d’approvisionnement provoquées par l’augmentation de la demande des consommateurs et le changement climatique, nécessite des approches alternatives. L’objectif de ce protocole est de faciliter l’identification des espèces botaniques à l’aide d’un système qPCR portatif sur le terrain ou dans n’importe quel contexte, où l’accès à l’équipement et à l’expertise de laboratoire est limité. L’ADN cible est amplifié à l’aide de qPCR à base de colorant, avec de l’ADN extrait de matériaux de référence botaniques servant de contrôle positif. L’ADN cible est identifié par son amplification spécifique et correspondant à son pic de fusion par rapport au contrôle positif. Une description détaillée des étapes et des paramètres, de la collecte d’échantillons pratiques sur le terrain à l’extraction de l’ADN, en passant par l’amplification des données, suivie d’une interprétation des données, a été incluse pour s’assurer que les lecteurs peuvent reproduire ce protocole. Les résultats obtenus s’alignent sur les méthodes traditionnelles d’identification botanique en laboratoire. Le protocole est facile à exécuter et rentable, permettant des tests de qualité sur les matières premières aussi près que possible du point d’origine de la chaîne d’approvisionnement.

Introduction

La pratique de l’utilisation des plantes pour maintenir et améliorer la santé remonte à des milliers d’années. En raison des tensions sur la chaîne d’approvisionnement apportées par l’augmentation de la demande des consommateurs1, les pratiques de récolte non durables et le changement climatique2, l’adultération botanique devient une préoccupation croissante dans l’industrie des aliments et des compléments alimentaires3. La présence d’espèces botaniques non déclarées ou mal identifiées peut entraîner une réduction de l’efficacité, voire des problèmes de sécurité. Par exemple, le cohosh noir (Actaea racemosa), utilisé pour traiter l’inconfort prémenstruel, peut être remplacé par une espèce asiatique à bas prix avec un soutien limité des données cliniques pour son efficacité4. Dans un cas plus grave, la substitution d’Aristolochia fangchi pour Stephania terandra dans une étude clinique pour la perte de poids utilisant des herbes chinoises a conduit à la néphrotoxicité grave et l’échec rénal chez certains participants5,6. Les deux espèces différentes partageaient un nom commun chinois ” Fang Ji « . Ces cas soulignent la nécessité d’un contrôle de la qualité plus strict, à commencer par l’identification des matières premières7, de préférence aussi près que possible du point d’origine de la chaîne d’approvisionnement, afin que les ressources puissent être affectées efficacement au matériau de l’identité correcte.

Un certain nombre d’approches orthogonales peuvent être utilisées pour l’identification botanique. Traditionnellement, l’identification botanique est effectuée par l’évaluation morphologique8,9 et les méthodes d’analyse chimique10,11,12,13. L’identification morphologique est basée sur les différences dans les caractéristiques macroscopiques et microscopiques des matériaux végétaux s’il existe des différences (figure 1). Cependant, l’absence de programmes de formation sur la botanique classique au cours des dernières années a entraîné une pénurie d’experts14, ce qui rend cette approche peu pratique pour le contrôle de la qualité de routine. Son application dans les matériaux botaniques en poudre est également limitée. Les méthodes d’analyse chimiques sont largement utilisées dans les pharmacopées et les laboratoires, mais ne sont pas idéales pour les essais sur le terrain en raison de la taille d’instruments tels que la chromatographie à couche mince haute performance (HPTLC), la chromatographie liquide haute performance (HPLC) et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN)(figure 2)et les exigences en matière d’environnement. Récemment, les méthodes génomiques sont apparues comme une technique alternative pour l’authentification et la détection de substitution des espèces botaniques et se sont avérées efficaces et précises. Les méthodes génomiques exploitent la haute fidélité et la spécificité de l’information génétique dans les matériaux végétaux15,16,17,18,19. Les outils de diagnostic moléculaire sont disponibles sous forme d’appareils portables, et comprennent souvent des outils automatisés d’interprétation des données qui abaissent la barrière à l’utilisation de la technologie, ce qui rend cette approche idéale pour l’identification sur le terrain20,21,22,23,24. Une fois que la méthode d’analyse moléculaire a été conçue et validée25,26,27, elle peut être exécutée par n’importe quel personnel ayant suivi une formation de base en biologie moléculaire. Parmi les différents outils portables disponibles, PCR en temps réel sur les séquences d’ADN est l’un des choix rentables28. La combinaison d’un appareil portable, ainsi que d’une analyse moléculaire personnalisée et validée, permet de vérifier les espèces botaniques et les ingrédients à l’extérieur du laboratoire, comme dans les fermes et les entrepôts de matériaux botaniques, ce qui réduit le temps et les coûts associés aux méthodes traditionnelles.

L’objectif de ce protocole est d’introduire une méthode d’identification botanique dans les situations où l’accès à l’équipement et à l’expertise de laboratoire est limité ou indisponible, à l’aide d’un système qPCR portable. La méthode est démontrée sur un champ de matricaria chamomilla (Figure 3A), communément connu sous le nom de camomille allemande, largement utilisé pour ses propriétés anti-inflammatoires et antioxydantes29. Il peut être confondu avec des espèces apparentées d’apparence ou d’odeur similaire, en particulier à partir des genres Chamaemelum, Tanacetum, et Chrysanthemum30,31,32. Parmi les espèces apparentées, Chamaemelum nobile, également connue sous le nom de camomille romaine, est une espèce notable avec des niveaux de production comparables dans le commerce (Figure 3B). La méthode démontrée a été conçue non seulement pour identifier l’espèce botanique cible M. chamomilla, mais aussi pour détecter son proche parent, C. nobile, basé sur une amplification spécifique des séquences d’ADN.

Cet article explique, en détail, comment effectuer l’identification botanique sur le terrain de M. chamomilla en utilisant qPCR à base de colorant intercalé et l’analyse de courbe de fonte sur un appareil portable. Le protocole comprend la collecte d’échantillons botaniques sur le terrain, l’extraction d’ADN sur place et la mise en place d’une réaction pcr en temps réel. Pour assurer une conclusion valable, l’ADN génomique botanique cible M. chamomilla et l’ADN génomique C. nobile botanique non ciblé, pré-extraits à partir de matériaux de référence botaniques certifiés, sont utilisés comme contrôle positif. La spécificité de cette méthode est démontrée par l’exécution des tests d’identification M. chamomilla et C. nobile individuellement sur des échantillons et des contrôles. Le contrôle négatif non-modèle est utilisé pour exclure les résultats faux positifs causés par la contamination par PCR.

Protocol

1. Prélèvement d’échantillons Installez une zone d’essai sur le terrain avec une surface plane et horizontale. Identifier une plante représentative qui reflète les caractéristiques de la majorité des plantes dans le champ de fleurs de camomille (Figure 4). Choisissez une tête de fleur de la plante représentative à l’aide de gants stériles. Placez l’échantillon dans un tube de collecte de 2,0 mL. Répétez les étapes de 1,3 à 1,4 et collectez un dépliant (environ 0,5–0,7 cm de long) de la même plante.REMARQUE : La fleur et la feuille de M. chamomilla sont assez petites pour s’asseoir au fond d’un tube de collecte de 2,0 mL. Pour d’autres plantes de surface plus grande, un poinçon ou des ciseaux en papier (rincés dans 70 % d’éthanol avant l’utilisation) peut être utilisé pour isoler des échantillons de tissus pour les tester. Lorsque plusieurs échantillonnages sont nécessaires, rincer le poinçon ou les ciseaux de papier entre la manipulation de différents échantillons. 2. Extraction d’ADN Préchauffer l’incubateur de bain sec à 95 °C. À chaque tube de collecte, ajoutez 100 μL de la solution d’extraction du kit d’extraction d’ADN végétal (répertorié dans le tableau des matériaux). Pour une meilleure efficacité d’extraction de l’ADN, broyer l’échantillon de tissu dans la solution d’extraction à l’aide d’un pilon tissulaire. Fermez le tube. Assurez-vous que le tissu botanique est recouvert de la solution d’extraction tout au long du processus d’extraction. Placer les tubes de collecte dans un incubateur de bain sec préchauffé et incuber les tubes de collecte à 95 °C pendant 10 min. Après 10 min, sortez les tubes de l’incubateur de bain sec. Ajouter 100 μL de la solution de dilution du même kit d’extraction d’ADN et mélanger la solution en faisant plusieurs fois de haut en bas. Répétez la même étape pour l’extraction de la brochure. Agiter pour mélanger davantage la solution. Le tissu végétal ne semble généralement pas être dégradé après ce traitement. La couleur liquide peut changer et devenir trouble.REMARQUE : La solution diluée peut être stockée à température ambiante pendant la nuit si elle ne se déroule pas immédiatement. Il n’est pas nécessaire d’enlever les débris cellulaires des tissus végétaux avant d’être entreposés. Le liquide dans les tubes contient les modèles d’ADN pour l’amplification en aval de PCR. 3. Configuration de réaction pcr Configurez les conditions de thermocyclage des instruments qPCR selon les spécifications du fabricant. Appliquer le profil thermocyclisme PCR indiqué dans (tableau 1), qui commence par une étape de température constante pour la dénaturation initiale, suivie de 25 cycles d’amplification, et se termine par une rampe de température pour obtenir une courbe de fusion haute résolution. Décongeler le mix principal et les amorces qPCR (tableau 2) à température ambiante avant l’utilisation. Planifiez la réaction qui sera chargée dans chaque puits : puits contenant un contrôle positif avec les espèces cibles, contrôle positif avec des espèces non visées, échantillons et contrôle négatif (figure 5). Dans cet exemple, dix puits sont utilisés – cinq pour le test d’identification de la camomille allemande et les cinq autres pour le test d’identification de la camomille romaine. Pour chaque type de test d’identification des espèces, un puits contient un contrôle positif avec de l’ADN extrait du matériel de référence des espèces ciblées, un puits contient un contrôle positif avec de l’ADN extrait du matériel de référence des espèces non ciblées, deux puits sont remplis d’échantillons d’ADN de fleurs et de feuilles extraits du champ, et un puits est attribué pour un contrôle négatif. Le tableau 3 décrit chaque type de puits. Préparer un master-mix de réaction selon le manuel pour chaque test d’identification des espèces botaniques. Un master-mix de réaction typique contient un mélange maître qPCR universel (2x), des amorces spécifiques aux espèces avant et inversées et de l’eau sans nucléase. Le tableau 4 répertorie la composition du système de réaction.REMARQUE : Si vous n’utilisez pas immédiatement, conservez le master-mix de réaction qPCR à +2 °C à +8 °C dans une glacière ou un mini-réfrigérateur. Mélanger soigneusement le master-mix de réaction par pipetage avant utilisation. Placez la cartouche qPCR face vers le haut sur une surface plate et stable. Chargez 18 μL du mélange principal de réaction configuré à l’étape 3.4 dans les puits de cartouche selon les puits définis à l’étape 3.3. Pour cette démonstration, ajoutez le mélange maître de réaction d’essai d’identification de camomille allemand dans les puits étiquetés pour l’essai gc (GCT dans les puits 1, 3, 5, 7, 9) et le mélange maître-mélange de réaction d’essai d’identification de camomille romaine dans des puits étiquetés pour l’essai de RC (RCT dans les puits 2, 4, 6, 8, 10) (voir figure 5). Transférer 2 μL d’ADN d’échantillon du supernatant des tubes d’extraction d’ADN et des contrôles positifs à l’ADN pré-extraits dans des puits de cartouche préchargés avec le mélange principal de qPCR. Après avoir ajouté chaque modèle d’ADN au mélange principal qPCR, mélangez doucement la solution par pipetage.REMARQUE : Évitez les débris cellulaires flottants lors du transfert de l’ADN du tube d’extraction de l’ADN. Utilisez minicentrifuge pour séparer les débris supernatants et cellulaires, si nécessaire. Sceller soigneusement la cartouche avec du film adhésif. Chargez la cartouche sur la chambre thermocyclante et fermez-la. Réglez l’instrument qPCR pour qu’il s’exécute.

Representative Results

Suivant le protocole décrit à la section 1, l’ADN botanique de la tête et de la feuille de fleurs a été extrait dans le supernatant après incubation thermique du tube de collecte à 95 °C pendant 10 min. Dans la présente étude, le supernatant a montré une couleur jaune et verdâtre pour la fleur et la feuille, indiquant qu’une variété de composés naturels ont été libérés dans le supernatant avec l’ADN botanique (Figure 6). Bien que l’amplification fiable de PCR ait été réalisée plus tard dans le triplement pour tous les modèles d’ADN extraits de champ, l’évaluation de la qualité de l’ADN a été exécutée en laboratoire comme référence. La concentration d’extrait d’ADN de tête de fleur, déterminée par fluorométrie, variait de 3,69 à 5,36 ng/μL, tandis que la concentration d’extrait d’ADN foliaire variait de 6,42–9,29 ng/μL. Les rapports d’absorption des extraits d’ADN des fleurs230 et des feuilles A260/A260 ont été mesurés par spectrophotométrie.260 Cependant, en raison du chevauchement entre l’ADN et le spectre phytochimique d’absorption UV, ces rapports n’ont pas pu être mesurés par fiabilité (données non montrées). Le colorant fluorescent intercalé a été utilisé pour surveiller l’amplification des fragments cibles en temps réel. Étant donné que les amorces spécifiques M. chamomilla et C. nobile ciblent la région de l’espaceur 2 (ITS2) transcrit interne, qui a des dizaines à des centaines d’exemplaires dans le génome de la plante, 25 cycles d’amplification pcr sont suffisants pour générer suffisamment d’amyplicons pour l’identification des espèces de camomille. À la figure 7, la valeur ct pour le contrôle positif de M. chamomilla dans le test d’identification de M. chamomilla était inférieure à 25 (GCP_GCT), tandis qu’après 25 cycles d’amplification, la fluorescence du même contrôle dans le test d’identification de C. nobile était inférieure au seuil de détection (GCP_RCT). D’autre part, après 25 cycles, la fluorescence pour le contrôle positif de C. nobile dans le test d’identification de M. chamomilla était inférieure au seuil de détection (RCP_GCT), tandis que la valeur de Ct pour le même contrôle dans le test d’identification de C. nobile était inférieure à 25 (RCP_RCT). L’amplification des contrôles positifs cibles et non ciblés dans leurs essais respectifs démontre la spécificité de l’essai d’identification M. chamomilla. Pour l’ADN de l’échantillon, l’extrait de la tête de fleur et de la feuille de champ a donné des valeurs ct de 15,18 et 19,41 dans le test d’identification de M. chamomilla, respectivement (Sample1(FLOWER)_GCT et Sample2(LEAF)_GCT). Ces deux échantillons n’ont pas été amplifiés dans le test d’identification de C. nobile (Sample1(FLOWER)_RCT et Sample2(LEAF)_RCT). Les modèles d’amplification des deux échantillons correspondaient au modèle d’amplification du contrôle positif de M. chamomilla. Les contrôles négatifs n’ont pas été amplifiés aux tests d’identification de M. chamomilla et de C. nobile (NC_GCT et NC_RCT), à l’exclusion de la possibilité de faux positifs causés par la contamination par pcr. Pour confirmer davantage l’amplification spécifique dans les contrôles positifs et les échantillons, des fractions de produit final PCR de chaque puits ont été exécutés sur 2% de gel agarose en laboratoire (Figure 8). Pour l’essai d’identification de M. chamomilla, les deux échantillons de champ ont donné des amplicons fonctionnant à la même position que le contrôle positif de M. chamomilla avec une taille estimée légèrement au-dessus de 100 bp (taille théorique 102 bp). Pour le test d’identification de C. nobile, le contrôle positif de l’espèce non cible C. nobile a donné une bande entre 50 et 100 pb, correspondant à la taille théorique de 65 pb. Le reste des voies ne présentait aucun produit d’amplification spécifique, ce qui était d’accord avec l’absence de signal fluorescent pour ces puits, comme on l’a observé lors d’essais sur le terrain. Après l’amplification de PCR, une analyse de courbe de fusion a été exécutée pour évaluer les caractéristiques de dissociation de l’ADN double-échoué (dsDNA) pendant le chauffage. Au fur et à mesure que la température augmentait au cours du cycle final pour l’analyse de la courbe de fonte, l’augmentation de la température a causé la dissociation des amypconses à double brin. Le colorant fluorescent intercalé a été progressivement libéré dans la solution, diminuant l’intensité de fluorescence (figure 9A). Le point d’inflexion de la première courbe dérivée a été utilisé pour déterminer la température de fusion (Tm) (Figure 9B), qui dépend principalement de la longueur du fragment d’ADN et de la teneur en GC. La combinaison de la valeur Ct avec la température de fusion peut augmenter la spécificité de l’analyse qPCR. Dans la présente étude, le pic de température de fusion de M. chamomilla contrôle positif PCR amplicon s’est produit à 85,6 °C (GCP_GCT) et il était distinct du pic de température de fusion de C. nobile contrôle positif PCR amplicon à 79,1 °C (RCP_RCT). L’amplcon PCR de la tête et des feuilles de fleurs de champ a produit des pics de température de fonte à 85,2 °C et 84,8 °C, respectivement (Sample1(FLOWER)_GCT et Sample2(LEAF)_GCT). Afin d’évaluer les variations de température de fusion mesurées par le système qPCR portatif, des points de données supplémentaires ont été recueillis pour confirmer que les températures de fusion des échantillons étaient toujours proches de la température de fusion obtenue à partir de M. chamomilla contrôle positif (à moins de 2 °C) et étaient loin de la température de fusion de l’amplicon de contrôle positif de C. nobile (Figure 10). Des pics de température de fonte ont parfois été signalés dans d’autres puits. Cependant, leurs valeurs de Ct n’étaient pas inférieures à 25 et les pics de température de fusion n’étaient pas proches de M. chamomilla ou C. nobile contrôle positif (plus de 2 °C à part). En résumé, le test d’identification M. chamomilla peut être interprété sur la base des règles de décision résumées au tableau 5. Avec tous les contrôles positifs testés positifs pour les espèces botaniques putatives, négatifs pour les autres espèces, et les contrôles négatifs test négatifs, les deux échantillons de champ ont été déterminés à contenir M. chamomilla, mais pas C. nobile. En outre, afin d’aligner les résultats des tests sur le terrain avec d’autres techniques d’analyse, les conclusions sur le terrain ont été confirmées par une méthode de codage à barres d’ADNprécédemment validée 25 (données non présentées). Figure 1 : Identification morphologique des matériaux botaniques. (A) Hibiscus rosa-sinensis fleurs, Curcuma longa racines, Malva Sylvestris feuilles, Rosmarinus officinalis feuilles, graines de sativum Coriandrum, Zingiber officinalle racines. (B) Les flocons de produits de Petroselinum crispum et d’Apium graveolens sont difficiles à différencier. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Identification chimique des matériaux botaniques. (A) instrument HPTLC et chromatogramme HPTLC représentatif. (B) instrument HPLC et un chromatogramme HPLC représentatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Matricaria chamomilla et Chamaemelum nobile sur le terrain. (A) Matricaria chamomilla, adapté de Wikipédia sous CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg. (B) Chamaemelum nobile, adapté de Wikipédia sous CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Collecte des pièces végétales de M. chamomilla du champ. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5 : Disposition des puits d’essai dans la démonstration. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 6 : Extrait d’ADN de champ dans les tubes de collecte. Le tissu botanique reste dans le tube d’origine et est recouvert d’extrait d’ADN jaunâtre. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 7 : Parcelle de fluorescence montrant l’accumulation de produits PCR sur 25 cycles de thermocyclisme. Le contrôle positif de M. chamomilla et le contrôle positif de C. nobile montrent des valeurs de Ct inférieures à 25 dans les essais d’identification de M. chamomilla et de C. nobile, respectivement. Les échantillons de fleurs et de feuilles de champ ont été amplifiés par le test d’identification de M. chamomilla avec des valeurs de Ct de 15.18 et 19.41. Le reste des puits n’a pas été amplifié. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 8 : Électrophorèse de gel des produits d’amplification pcr de champ. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 9 : Analyse de la température de fusion. (A) Le signal de fluorescence dans chaque puits diminue avec l’augmentation de la température. (B) L’identité des produits PCR a été confirmée par le pic de température de fonte dans l’analyse des courbes de fusion. Les échantillons de fleurs et de feuilles de champ montrent des pics à 85,2 °C et 84,8 °C. Ceux-ci sont proches du pic produit par M. chamomilla contrôle positif. Le contrôle positif de C. nobile a produit un pic à 79.1 °C, qui est différent des trois autres échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 10 : Variation de crête de température de fusion entre les échantillons de contrôle positif et les échantillons de champ. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Étape Cycle Température Heure Température constante 1 95 °C Années 60 Amplification 25 95 °C Années 30 60 °C Années 30 Courbe de fusion 1 60 °C Rampe 0.05 °C/s 95 °C Tableau 1 : conditions de thermocyclisme qPCR pour les tests d’identification M. chamomilla et C. nobile. Test Nom de l’amorce Séquence 5′-3′ Position Région Taille d’Amplicon Matricaria recutita ZL3 TCGTCGGGCGCAAGGATAAG Avant ITS2 102 pb ZL4 TAAACTCAGGGGTAGTCCC Inverse Chamaemelum nobile ZL11 TGTGCACCTTGCTAGGAAGCA Avant ITS2 65 pb ZL12 TCGAAGGCTCATCCTAAGACAAC Inverse Tableau 2 : Paires d’amorces pour les tests d’identification M. chamomilla et C. nobile. Position de puits Eh bien nom Description 1 GC_PosCtrl_GC_Test Contrôle positif à la camomille allemande sous le test GC 2 GC_PosCtrl_RC_Test Contrôle positif de la camomille allemande sous rc test 3 RC_PosCtrl_GC_Test Contrôle positif de la camomille romaine sous le test GC 4 RC_PosCtrl_RC_Test Contrôle positif de la camomille romaine sous rc test 5 Field_Sample_GC_Test Échantillon de tissu foliaire au test GC 6 Field_Sample_RC_Test Échantillon de tissu foliaire sous rc test 7 Field_Sample_GC_Test Échantillon de tissu floral en vertu du test GC 8 Field_Sample_RC_Test Échantillon de tissu floral sous rc test 9 NegCtrl_GC_Test Échantillon de contrôle négatif sous le test GC 10 NegCtrl_RC_Test Échantillon de contrôle négatif sous rc test Tableau 3 : Types de puits et descriptions pour les tests d’identification de M. chamomilla et C. nobile. Réactif GC_Test RC_Test Mélange qPCR universel* 10 μL 10 μL Amorce ZL3 (10 μM) 0,4 μL Na Amorce ZL4 (10 μM) 0,4 μL Na Amorce ZL11 (10 μM) Na 0,4 μL Amorce ZL12 (10 μM) Na 0,4 μL H2O (sans nucléase) 7,2 μL 7,2 μL * contient Hot Start Taq ADN Polymérase Tableau 4 : Composition du mélange principal pour les tests d’identification M. chamomilla et C. nobile. Nom du puits Résultat attendu Critères de résultat positifs Critères de résultat négatifs Détecté / Présent Non détecté / Absent GC_PosCtrl_GC_Test Détecté Ct < 25 et 84 <= Tm <= 86 – GC_PosCtrl_RC_Test Non détecté – Aucune valeur Ct dans les 25 cycles RC_PosCtrl_GC_Test Non détecté – Aucune valeur Ct dans les 25 cycles RC_PosCtrl_RC_Test Détecté Ct < 25 et 79 <= Tm <= 81 – Field_Sample_Leaf_GC_Test Présent Ct < 25 et 84 <= Tm <= 86 Aucune valeur Ct dans les 25 cycles Field_Sample_Leaf_RC_Test Absent – Aucune valeur Ct dans les 25 cycles Field_Sample_Flower_GC_Test Présent Ct < 25 et 84 <= Tm <= 86 Aucune valeur Ct dans les 25 cycles Field_Sample_Flower_RC_Test Absent – Aucune valeur Ct dans les 25 cycles NegCtrl_GC_Test Non détecté – Aucune valeur Ct dans les 25 cycles NegCtrl_RC_Test Non détecté – Aucune valeur Ct dans les 25 cycles Tableau 5 : Règles relatives à l’interprétation des résultats de la RPPC.

Discussion

La conception des amorces et la sélection des modèles sont les étapes cruciales pour obtenir une amplification qPCR efficace et spécifique. Après avoir identifié un modèle approprié, le logiciel de conception d’amorce est généralement utilisé pour faciliter la sélection des amorces basées sur des variables de conception telles que la longueur d’amorce, la température de fusion, et le contenu GC33,34. L’optimisation et la validation peuvent être effectuées dans les conditions expérimentales attendues de l’essai afin d’assurer la spécificité, la sensibilité et la robustesse d’une réaction PCR35. La conception d’amorces sous-optimales peut entraîner la formation d’amorce-dimer, dans le cas où les interactions d’amorce produisent des produits non spécifiques36.

Les contrôles sans modèle (CNT) utilisés dans cette étude vérifient à la fois la contamination par l’ADN et la présence de dimers d’amorce qui pourraient affecter l’essai. Les résultats n’ont montré aucune amplification, une bonne indication que la contamination de l’ADN et les amorces-dimers ne sont pas une préoccupation. La contamination de l’ADN et les dimers d’amorce se manifestent dans les courbes de fonte sans contrôles de modèle, et comme pics supplémentaires dans les courbes de fonte des contrôles positifs. En règle générale, on s’attend à ce que la courbe de fusion d’un contrôle positif contienne un seul pic, à moins que les sous-domaines riches en AT dans le modèle ne provoquent une fonte inégale. Des pics doubles pourraient être prédits en simulant des tests de fusion à l’aide du logicieluMELT 37. Dans cette étude, l’étalon-or de l’exécution du produit PCR sur le gel agarose a été utilisé pour confirmer la présence du produit PCR cible et l’absence de contamination et d’amorces.

Un défi considérable dans l’analyse moléculaire des matériaux botaniques est l’obtention d’UN ADN de bonne qualité à la suite du processus d’extraction de l’ADN botanique. Les matériaux botaniques sont échangés et consommés pour les composés chimiques actifs qui sont associés à des avantages pour la santé. Dans le processus d’extraction de l’ADN, ces composés chimiques seront également libérés dans la solution d’extraction d’ADN, causant potentiellement l’inhibition de PCR, ayant ainsi comme conséquence des échecs dans l’amplification de PCR. Divers kits de purification de l’ADN végétal utilisant des solvants organiques et des colonnes ont été développés pour éliminer les composés chimiques dérivés des plantes38. Toutefois, le capot à fumée et la centrifugeuse à grande vitesse nécessaires pour aider ces trousses ne sont pas disponibles sur le terrain.

Dans le protocole actuel, la méthode simplifiée d’extraction de l’ADN utilise un kit d’extraction d’ADN végétal commercial (voir tableau des matériaux pour plus de détails). Il a eu la capacité de neutraliser les substances inhibitrices communes pour des résultats reproductibles et a produit des résultats cohérents pour M. chamomilla et C. nobile. Les têtes et les feuilles de fleurs de M. chamomilla et de C. nobile ont donné des amypons de PCR avec des pics de fonte spécifiques, indiquant que la présence d’inhibiteurs de PCR n’était pas une préoccupation. Pour d’autres plantes avec des niveaux plus élevés d’inhibiteurs de PCR, amplifier l’ADN dans leur extraction originale peut être moins efficace. Pour réduire l’inhibition et améliorer l’efficacité de l’amplification, avec l’accès à l’ensemble de la plante, d’autres parties végétales à faible teneur en polysaccharide et polyphénol peuvent également être utilisées à des fins d’identification. S’il y a un accès limité à différentes parties végétales, les feuilles plus jeunes ou les pétales disséqués à partir de têtes de fleurs, qui ont généralement une teneur en phénolique inférieure39, peuvent offrir de meilleures chances de succès. Étant donné que les séquences d’ADN sont cohérentes sur l’ensemble de la plante, toute pièce végétale peut être utilisée pour confirmer l’identité de l’espèce. Si l’amplification du PCR est encore sous-optimale, l’extrait d’ADN original peut être dilué avant pcr, ou des protocoles de purification de laboratoire plus sophistiqués peuvent être utilisés.

Un autre défi pour l’analyse pcr est les résultats faux positifs causés par la contamination de l’ADN, qui peut avoir un impact négatif sur l’interprétation des données. Il est habituellement contrôlé par l’entretien ménager actif, l’utilisation d’équipement dédié, et la restriction des travaux aux zones désignées. À l’aide de qPCR, toutes les analyses PCR peuvent être effectuées dans un système fermé, ce qui réduit considérablement les risques de contamination par l’ampplicon PCR dans un environnement qui n’est pas bien contrôlé. En outre, l’ADN environnemental ne devrait pas non plus montrer un faux positif en raison de la spécificité de l’essai, selon une étude de validation précédente40.

Il y a place à l’amélioration. Dans le protocole présenté ici, le colorant intercalant a été utilisé pour montrer l’amplification des fragments cibles en temps réel. La spécificité de la méthode est en outre confirmée par la température de fusion caractéristique, qui est distincte entre M. chamomilla et C. nobile amplicons. Par conséquent, l’intercalation de la PCR à base de colorants peut répondre efficacement à la question « Qu’est-ce que cette espèce végétale? » sur le terrain. Toutefois, en plus de la nécessité d’effectuer l’identification botanique sur une seule plante isolée du champ, dans de nombreuses circonstances, les poudres ou extraits botaniques de l’entrepôt bénéficieront également d’une évaluation rapide de l’identité sur place. Pour ces types de matériaux, des questions supplémentaires peuvent devoir être abordées, telles que « Qu’y a-t-il dans ce matériau ? », « Contient-il les espèces botaniques que je recherche ? », « Contient-il des adultères que je veux éviter ? » et « Est-il remplacé en tout ou partie par d’autres espèces botaniques nuisibles ? ». Au lieu d’utiliser un colorant intercalé, différentes sondes qPCR peuvent être conçues pour cibler les amplicons de différentes plantes dans un système de réaction, tout en maintenant une grande spécificité et efficacité de l’essai. Le développement d’un qPCR basé sur une sonde et l’utilisation d’un système qPCR portable qui offre la détection de plusieurs canaux peuvent étendre davantage l’application des essais sur le terrain comme un test adapté aux besoins à un environnement plus large, tels que les entrepôts de matériaux botaniques et les centres de distribution pour répondre à des questions plus compliquées. En outre, l’utilisation de plusieurs sondes permet également à l’utilisateur d’inclure l’amplification interne dans chaque système de réaction, de sorte que plus d’informations seront disponibles lorsque l’inhibition pcr est suspectée.

Le protocole présenté ici présente les avantages suivants par rapport aux technologies existantes utilisées à des fins identiques. Premièrement, pour les méthodes traditionnelles d’identification morphologique et chimique, la procédure et ses résultats doivent être menés et interprétés par des experts. Les tests d’identification basés sur la QPCR peuvent être effectués par des personnes ayant suivi une formation de base en biologie moléculaire et interprétés de manière plus normalisée. Deuxièmement, comparativement à l’identification et à la différenciation des espèces basées sur la QPCR normalement effectuées en laboratoire, le protocole d’identification sur le terrain à l’aide d’un instrument portatif ne nécessite pas d’instruments à forte empreinte, comme une centrifugeuse à grande vitesse, un équipement d’évaluation de la qualité de l’ADN, un cycleur thermique avec détecteur de fluorescence et un ordinateur exécutant un logiciel spécial. Ainsi, l’identification des espèces à base d’ADN peut être effectuée dans n’importe quel contexte sans délai. Troisièmement, la recherche de matériaux botaniques est une tâche qui nécessite une opération mondiale. Avec les progrès des services cloud et de l’intelligence artificielle, un appareil portable peut potentiellement recevoir des méthodes développées et validées par des experts en laboratoire, être exploité par des non-experts dans des régions éloignées, et produire des certifications objectives de tiers. Par conséquent, cette option est plus convaincante que jamais avec le travail à distance devenant la tendance.

En résumé, le protocole présentait l’identification sur le terrain de M. chamomilla à l’aide d’un système qPCR portatif. L’application réussie de cette technique produira des résultats très précis sur l’identification botanique et aidera les fabricants et les fournisseurs botaniques à qualifier les matériaux botaniques en temps opportun et de façon rentable.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions James Shan pour ses efforts dans l’enregistrement vidéo sur le terrain. Nous remercions Jon Byron et Matthew Semerau pour leur travail dans le montage vidéo. Nous remercions Ansen Luo, Harry Du et Frank Deng pour leur soutien dans la localisation du champ d’essai. Nous remercions Maria Rubinsky pour ses précieux commentaires sur l’ensemble du manuscrit. Toutes les personnes reconnues sont des employés de Herbalife International of America, Inc.

Materials

Battery TNE 78000mAh Provide field power supply
bCUBE HYRIS bCUBE 2.0 Portable qPCR instrument
Cartridges(16 Well) HYRIS NA Consumables for bCUBE
Electric pipette Eppendorf NA Handling liquid
Extract-N-AmpTM plant PCR kit SIGMA XNAP2-1KT Plant DNA extraction kit
German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials AHP 2264 Used as positive control
Mini dry bath Yooning MiniH-100L For DNA extraction
Nuclease-free water AMBION AM9937 qPCR reaction
Primer Thermo Fisher Scientific NA qPCR reaction
Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials ChromaDex ASB-00030806-005 Used as positive control
Luna universal qPCR master mix NEB M3003L qPCR reaction
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References

  1. Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018. HerbalGram. 123, 62-73 (2019).
  2. Israelsen, L. D. The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change. Planta Medica. 74 (3), 36 (2008).
  3. Cardellina, J. H. Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry. Journal of Natural Products. 65 (7), 1073-1084 (2002).
  4. Foster, S. Exploring the peripatetic maze of black cohosh adulteration: a review of the nomenclature, distribution, chemistry, market status, analytical methods and safety. HerbalGram. 98, 32-51 (2013).
  5. Vanherweghem, J. L. Misuse of herbal remedies: The case of an outbreak of terminal renal failure in Belgium (Chinese herbs nephropathy). The Journal of Alternative and Complementary Medicine. 4 (1), 9-13 (1998).
  6. Vanherweghem, J. L., et al. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs. The Lancet. 341 (8842), 387-391 (1993).
  7. Khan, I. A., Smillie, T. Implementing a “quality by design” approach to assure the safety and integrity of botanical dietary supplements. Journal of Natural Products. 75 (9), 1665-1673 (2012).
  8. Applequist, W. . The Identification of Medicinal Plants: A Handbook of the Morphology of Botanicals in Commerce. , (2006).
  9. Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., Länger, R., Williamson, E. . American Herbal Pharmacopoeia: Botanical Pharmacognosy – Microscopic Characterization of Botanical Medicines. , (2016).
  10. Frommenwiler, D. A., et al. Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug – the case of angelica gigas root. Planta Medica. 84 (6-7), 465-474 (2018).
  11. Heyman, H. M., Meyer, J. J. M. NMR-based metabolomics as a quality control tool for herbal products. South African Journal of Botany. 82, 21-32 (2012).
  12. Lazarowych, N. J., Pekos, P. Use of fingerprinting and marker compounds for identification and standardization of botanical drugs: strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products. Drug Information Journal. 32 (2), 497-512 (1998).
  13. Tankeu, S., et al. Hyperspectral imaging and support vector machine: a powerful combination to differentiate black cohosh (actaea racemosa) from other cohosh species. Planta Medica. 84 (6-7), 407-419 (2018).
  14. Rodman, J. E., Cody, J. H. The taxonomic impediment overcome: NSF’s Partnerships for Enhancing Expertise in Taxonomy (PEET) as a model. Systematic Biology. 52 (3), 428-435 (2003).
  15. Chen, S., et al. A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA. Biotechnology Advances. 32 (7), 1237-1244 (2014).
  16. Li, X., et al. Plant DNA barcoding: from gene to genome. Biological Reviews. 90 (1), 157-166 (2015).
  17. Madesis, P., Ganopoulos, I., Sakaridis, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products. Food Research International. 60, 163-172 (2014).
  18. Newmaster, S. G., Ragupathy, S., Janovec, J. A botanical renaissance: state-of-the-art DNA bar coding facilitates an automated identification technology system for plants. International Journal of Computer Applications in Technology. 35 (1), 50-60 (2009).
  19. Parveen, I., Gafner, S., Techen, N., Murch, S. J., Khan, I. A. DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: strengths and limitations. Planta Medica. 82 (14), 1225-1235 (2016).
  20. Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. A pocket-sized convective PCR thermocycler. Angewandte Chemie International Edition. 46 (23), 4316-4319 (2007).
  21. Almassian, D. R., Cockrell, L. M., Nelson, W. M. Portable nucleic acid thermocyclers. Chemical Society Reviews. 42 (22), 8769-8798 (2013).
  22. Benítez-Páez, A., Portune, K. J., Sanz, Y. Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinION portable nanopore sequencer. Gigascience. 5 (1), 4 (2016).
  23. Emanuel, P. A., et al. Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler. Journal of Clinical Microbiology. 41 (2), 689-693 (2003).
  24. Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228 (2016).
  25. Lu, Z., et al. Single-laboratory validation of a two-tiered DNA barcoding method for raw botanical identification. Journal of AOAC International. 102 (5), 1435-1447 (2019).
  26. Sgamma, T., et al. DNA barcoding for industrial quality assurance. Planta Medica. 83 (14-15), 1117-1129 (2017).
  27. Wallinger, C., et al. Rapid plant identification using species-and group-specific primers targeting chloroplast DNA. PLoS One. 7 (1), 29473 (2012).
  28. Newmaster, S. G., et al. Recommendations for validation of real-time PCR methods for molecular diagnostic identification of botanicals. Journal of AOAC International. , (2019).
  29. Singh, O., Khanam, Z., Misra, N., Srivastava, M. K. Chamomile (Matricaria chamomilla L.): an overview. Pharmacognosy Reviews. 5 (9), 82 (2011).
  30. Mills, S. Y., Bone, K. The Essential Guide to Herbal Safety. Elsevier Health Sciences. , 325 (2004).
  31. Avula, B., et al. Quantitative determination of phenolic compounds by UHPLC-UV-MS and use of partial least-square discriminant analysis to differentiate chemo-types of Chamomile/Chrysanthemum flower heads. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 278-288 (2014).
  32. Guzelmeric, E., Vovk, I., Yesilada, E. Development and validation of an HPTLC method for apigenin 7-O-glucoside in chamomile flowers and its application for fingerprint discrimination of chamomile-like materials. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 108-118 (2015).
  33. Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. Genome Research. 3 (3), 30-37 (1993).
  34. Untergasser, A., et al. Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3. Nucleic Acids Research. 35, 71-74 (2007).
  35. Bustin, S., Huggett, J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).
  36. Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3235-3241 (1997).
  37. Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
  38. Heikrujam, J., Kishor, R., Mazumder, P. B. The chemistry behind plant DNA isolation protocols. Biochemical Analysis Tools – Methods for Bio-Molecules Studies. , (2020).
  39. Blum-Silva, C. H., Chaves, V. C., Schenkel, E. P., Coelho, G. C., Reginatto, F. H. The influence of leaf age on methylxanthines, total phenolic content, and free radical scavenging capacity of Ilex paraguariensis aqueous extracts. Revista Brasileira de Farmacognosia. 25 (1), 1-6 (2015).
  40. Lu, Z., et al. Validation of a targeted PCR method for raw and processed botanical material identification: an example using matricaria chamomilla (chamomile). Journal of AOAC International. 102 (6), 1787-1797 (2019).

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Citer Cet Article
Yang, Z., Quan, Z., Chua, T., Li, L., Zhang, Y., Babajanian, S., Buongiorno, F., Noce, I. D., Colombo, L., Newmaster, S., Chua, T., Chang, P., Swanson, G., Lu, Z. Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System. J. Vis. Exp. (164), e60940, doi:10.3791/60940 (2020).
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