Um método de triagem para identificação de drogas promotoras de heterocromatina usando drosophila
Summary
Drosophila é um modelo experimental amplamente utilizado adequado para o rastreamento de medicamentos com aplicações potenciais para a terapia do câncer. Aqui, descrevemos o uso de fenótipos de cor dos olhos variegated drosophila como um método para triagem de compostos de pequenas moléculas que promovem a formação de heterocromatina.
Abstract
Drosophila é um excelente organismo modelo que pode ser usado para testar compostos que podem ser úteis para a terapia do câncer. O método descrito aqui é um método econômico in vivo para identificar compostos promotores de heterocromatina usando Drosophila. A cepa DX1 da Drosophila, tendo um fenótipo de cor dos olhos variegated que reflete as extensões da formação de heterocromatina, fornecendo assim uma ferramenta para uma tela de drogas promotora de heterocromatina. Neste método de triagem, a variegação ocular é quantificada com base na área superficial da pigmentação vermelha ocupando partes do olho e é pontuada em uma escala de 1 a 5. O método de triagem é simples e sensível e permite testar compostos in vivo. O rastreamento de medicamentos usando este método fornece uma maneira rápida e barata de identificar drogas promotoras de heterocromatina que poderiam ter efeitos benéficos na terapêutica do câncer. Identificar compostos que promovam a formação de heterocromatina também pode levar à descoberta de mecanismos epigenéticos do desenvolvimento do câncer.
Introduction
Heterocromatina é uma forma condensada de DNA que desempenha um papel central na expressão genética, na regulação da segregação do cromossomo durante a divisão celular, e na proteção contra a instabilidade do genoma1. A heterocromatina tem sido considerada um regulador de repressão genética e para proteger a integridade do cromossomo durante a mitose celular2,3. Está associada à di e trimetilação da histona H3 lysina 9 (H3K9me) durante o compromisso de linhagem4,5. Além disso, o recrutamento de proteína heterocromatina 1 (HP1) proteínas de cromodomínio também é considerado associado com heterocromatina e repressão epigenética da expressão genética6. Essas proteínas são componentes essenciais e marcadores da formação de heterocromatina.
Uma vez que a instabilidade genômica permite que as células adquiram alterações genéticas que promovam a carcinogênese, a heterocromatina está se tornando mais reconhecida no desenvolvimento do câncer e pode ser direcionada para o tratamento do câncer7,8. Atualmente, não existem drogas bem estabelecidas para auxiliar a formação de heterocromatina. Aqui, apresentamos um método simples e rápido, mas eficiente, para triagem de compostos de pequenas moléculas que promovem a formação de heterocromatina. A triagem é feita tratando Drosophila com uma biblioteca de drogas de pequenas moléculas. Este método aproveita um fenótipo de cor dos olhos variegated na cepa DX1Drosophila que é influenciada pelos níveis de heterocromatina. As moscas DX1 contêm uma matriz tandem de sete transgenes P[lac-w], que têm a expressão variegated/depressão dependendo da heterocromatização, portanto, a extensão da variegação na cor dos olhos reflete o nível de heterocromatina. Especificamente, o aumento da heterocromatina poderia ser detectado pela proporção crescente da cor variegated dos olhos (olho branco). Pelo contrário, a diminuição da heterocromatina seria detectada pela proporção crescente da expressão transgênica P[lac-w] (olho vermelho)9,,10,,11,12.
Portanto, aproveitamos este sistema transgênico drosophila que produz um fenótipo de cor dos olhos variegated, uma vez que sua expressão está diretamente correlacionada com a quantidade de heterocromatina presente. Após a descoberta de compostos suspeitos de promover a formação de heterocromatina, podemos confirmar essa suspeita usando outros métodos, como a mancha ocidental. Essas substâncias promotoras da heterocromatina podem ser desenvolvidas para ensaios clínicos em pacientes no futuro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heterocromatina é uma forma condensada de DNA que desempenha um papel central na regulação da expressão genética. Está se tornando cada vez mais reconhecida no câncer e pode servir como um alvo potencial para a terapia do câncer15,16,17,18. Compostos de pequenas moléculas são comumente usados no desenvolvimento de drogas devido a vantagens na fabricação, preservação e metabolismo …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a J. Birchler, E. Bach e ao Bloomington Drosophila Stock Center por várias cepas de Drosophila; o Programa de Terapêutica de Desenvolvimento do Instituto Nacional do Câncer (NCI) para a biblioteca de medicamentos de pequenas moléculas do Instituto Nacional do Câncer (INCa); Estudantes de graduação da UCSD, incluindo Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza e Alex Chavez. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada por uma bolsa de pesquisa da American Thoracic Society para J.L. e financiamento do NIH: R01GM131044 para W.X.L.
Materials
| Drosophila | DX1 strain | DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri) | |
| Drosophila food media | UCSD fly kitchen | ||
| Methotrexate | NCI drug library | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Ethyl alcohol | Sigma | E7023-500ML |
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