В Vivo Hydroxyl радикальный белок следдля изучения взаимодействия белков в Caenorhabditis elegans

1. C. elegans техническое обслуживание и культура Выращивайте и синхронизируйте колонии червей до четвертой стадии личинок (L4) в соответствии со стандартными лабораторными процедурами8. День IV-FPOP эксперимент, мыть L4 червей из бактериальных газонов (OP50 E. coli) с m9 буфера (0.02 M KH2PO4, 0,08 M Na2HPO4, 0,08 M NaCl, 1 мМ MgSO4). Получите 500 аликвот из 10 000 червей на IV-FPOP образца. 2. Сборка системы микрожидкости Начните сборку системы потока, разрезав 2 см кусок фторированного этилена пропилена (FEP) трубки (1/16 дюйма внешнего диаметра (o.d.) x 0.020 дюйма внутреннего диаметра (т.д.)). Используя чистую рассекающую иглу, расширьте i.d. труб FEP, чтобы сделать небольшой кратер только на одном конце, 50 мм в длину. Кратер должен быть достаточно большим, чтобы соответствовать двум 360 мкм o.d. кусочки слиэтого кремния.ПРИМЕЧАНИЕ: Не расширяйте противоположный конец, так как этот конец будет использоваться только для того, чтобы соответствовать капилляру розетки. С помощью керамического резака вырежьте два 15 см кусочка 250 мкм т.д. сливного кремния. Эти две части станут вливая линии системы потока. Используя самоклеящуюся ленту, лента два 250 мкм т.д. капилляры вместе обеспечения они параллельны друг другу и их концы 100% покраснел.ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения сросшиеся концы кремнезема не измельчаются после резки, и прямые и 100% покраснел друг против друга, рекомендуется изучить их с помощью увеличительного стекла или под стерео микроскопом. Вставьте два лентой капилляров в ручной кратер труб FEP. Нажмите капилляры до самого края кратера ручной работы.ВНИМАНИЕ: Для поддержания эффективности системы потока, не проталкивайте кратер ручной работы(рисунок 1a). Поместите небольшую точку эпоксидной смолы на чистую поверхность и смешайте с рассекающей иглой. Быстро, используя ту же иглу, место небольшую каплю смолы в конце вливая капилляры, где они соединяются с трубами FEP и позволяют смолы, чтобы высохнуть, висит розетки вверх, в течение нескольких минут (Рисунок 1a). В то время как мизанта высыхает, связывая трубки FEP и два капилляра вместе, вырежьте новый 250 мкм i.d. капилляр. Новый капилляр станет выходной капилляром системы потока. Пожеланную длину капилляра можно вычислить с помощью приведенного ниже уравнения:Там, где l длина капилляра должна быть разрезана в сантиметрах, т является желаемым временем реакции в минутах, f – это скорость потока в мЛ/мин, и т.д. – это внутренний диаметр капилляра в сантиметрах.ПРИМЕЧАНИЕ: После резки выход капилляра, изучить концы обеспечения они прямые и не дробленая. После того, как мизаня высохла, вставьте новый капилляр через конец трубы FEP. Внутренние концы капилляра розетки и два вливающих капилляры должны быть заподлицо друг против друга внутри труб FEP, это создает смешивания-T (Рисунок 1b). Свяжите капиллярную капиллярную и feP-трубку свежей эпоксидной смолой, описанной в шагах 2.6 и 2.7. Разрешить сушу на ночь, чтобы высохнуть, связывая систему потока вместе. Настройка микрофлюидной системы потока на следующий день(рисунок 1c). 3. Микрофлюидическая система потока для in vivo FPOP Вставьте четыре магнитных мешалки внутри одного шприца 5 мл. Этот шприц становится образцом шприца. Магнитные мешалки предотвратить червей от урегулирования внутри шприца во время IV-FPOP(рисунок 2A). Заполните два шприца 5 мл с M9. Убедитесь, что внутри каждого шприца нет пузырьков воздуха, так как они могут повлиять на скорость потока и эффективность смешивания. Подключите адаптер Luer к каждому шприцу 5 мл, гарантируя, что они плотно закрепились и закреплены на месте. Прикрепите каждый шприц к одному 3-2 клапану. Шприц должен быть прикреплен к среднему порту клапана(рисунок 2B). Закрепите каждый шприц 5 мл к двойному шприцу насоса и отрегулируйте механический воротник стопа, чтобы предотвратить чрезмерное давление на шприц от блока толкателя. Имейте в виду добавление магнитных мешалки при установке стоп воротник. Прикрепите каждый вливая капиллярный конец домашней микрофлюидной системы потока к верхнему порту каждого 3-2 клапана, используя супер flangeless гайка, FEP рукав, и супер flangeless ferrule (Рисунок 2B). К оставшемуся открытому порту 3-2 клапана (нижний порт) прикрепите 10 см 450 мкм, т.д. капилляр, используя супер флэнезебры гайки, рукав FEP и супер флавенжеры ferrule(рисунок 2B). Эти капилляры становятся выдавливными образцами капилляров. Запустите поток насоса и проверьте все соединения микрофлюидной системы потока на наличие визуальных утечек. Поток по крайней мере три шприца объемов, используя экспериментальную скорость потока. Конечная скорость потока зависит от окна лазерного облучения, лазерной частоты и объема фракции с нулевым исключением.ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола, конечная скорость потока 375,52 л/мин была рассчитана из окна лазерного облучения 2,55 мм, 250 мкм т.д. сросшиеся кремнезема, нулевая фракция исключения, и 50 Гц частоты. Путь потока отмечен стрелками на ручке клапана 3-2. Каждый шприц можно пополнить вручную, переместив ручку клапана из положения высыхающего в положение снятия.ПРИМЕЧАНИЕ: Утечки на 3-2 клапана могут быть исправлены путем повторного завинчивания супер flangeless гайки или заменив любой из клапана соединения (супер flangeless гайки, FEP рукав, или супер flangeless ferrule). Утечки на смешивании-T требуют повторной сборки микрофлюидной системы потока (шаги от 2.1 до 2.11). Переместите микрофлюидную систему потока на экспериментальную скамейку и закрепите капилляр розетки на излучение, используя союз из нержавеющей стали 360 мкм(рисунок 2C,D). Используя дальнобойную зажигалку, сожгите покрытие слиэтого кремнезема в окне лазерного облучения. Очистите обожженое покрытие с помощью ткани, свободной от ворса и метанола.ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные циклы горения и метанола очистки циклов, чтобы избежать перегрева капилляра, как избыток тепла может расплава и / или разорвать капилляра. Расположите блок магнитного мешалки над шприцем 5 мл, содержащим магнитные мешалки. Отрегулируйте скорость и положение блока магнитного мешалки так, чтобы магнитные мешалки внутри шприца 5 мл вращались медленно и постоянно. 4. In vivo FPOP Включите эксимерный лазер KrF и дайте тиратрону прогреться.ВНИМАНИЕ: Лазер излучает видимое и невидимое излучение на длине волны 248 нм, что может повредить глаза. Надлежащая защита глаз следует носить перед включением лазера и открытием окна выхода луча. Измерьте энергию лазера на частоте 50 Гц для по крайней мере 100 импозав, разместив оптический датчик в окне выхода луча.ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола использовалось окно облучения калибра 2,55 мм с лазерной энергией в 150 и 2,32 мДж. Получить приблизительно 10000 червей (500 л) и вручную вывести образец в образец шприца. Заполните образец шприца 2,5 мл буфера M9 для окончательного объема образца 3 мл. Убедитесь, что пузырьки воздуха не вводятся в образец шприца. Заполните второй шприц с 3 мл 200 мМ H2O2, снова обеспечение не воздушные пузырьки вводятся в шприц. В конце капилляра розетки, место 15 мл конической трубки, завернутые в алюминиевую фольгу, содержащую 6 мл 40 мм N’-Dimethylthiourea (DMTU), 40 мм N-терт-Бутил-я-фенилнитрон (PBN), и 1% диметил сульфок, чтобы утолить избыток2H’-Di2, гидроксил радикальная активность, и метафинина сульфида.2 Запустите эксимерный лазер из окна программного обеспечения, подождите первого импульса и начните поток образца из двойного шприца.ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть запущены в биологических дубликатов в технических трипликатов в 3 образцах условиях: лазерное облучение с H2O2 (образец), нет лазерного облучения с H2O2 и нет лазерного облучения no H2O2 (контроль), в общей сложности до 9 образцов на биологический набор. Соберите весь образец в трубке 15 мл, при этом активно отслеживая поток образцов для любых визуальных утечек, так как некоторое давление спины от образца шприца иногда может накапливаться. После IV-FPOP, гранулы червей центрифугирования при 805 х г в течение 2 мин. Удалите раствор утоления, добавьте 250 л люсис буфера (8 M мочевины, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 мм NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ phenmethyllfonyl флуорид . Перенесите образец в чистую микроцентрифуговую трубку, заморозите вспышку и храните при -80 градусов по Цельсию до пищеварения образца. 5. Экстракция белка, очищение и протеолиза Оттепель замороженных образцов на льду и гомогенизации путем sonication в течение 10 с, а затем 60 с ледяной инкубации. Несколько раундов sonication может потребоваться, гоменат можно наблюдать под стереомикроскоп, поместив 2 зл образца aliquot на слайд микроскопа. Образец гомогенизации завершается, когда малы, чтобы не куски червей видны. Centrifuge гомогенизированных червей на 400 х г в течение 5 мин при 4 кв и собирать супернатанта в чистую микроцентрифугую трубку. Определите концентрацию белка образца с помощью анализа бисингониновой кислоты (BCA assay) с использованием инструкций производителя.ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация образца может быть определена с помощью любого биохимического протеинового анализа по выбору. Имейте в виду совместимость реагентов с буфером лисиса (8 М мочевины, 0,5% SDS, 50 мМ HEPES, 50 мм NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ PMSF). Кроме того, может потребоваться разбавление буфера. Получить 100 мкг белка из каждого образца и поместить в чистые микроцентрифуговых труб. Добавьте дитиотрейтол (ДТТ) к конечной концентрации 10 мМ, чтобы уменьшить дисульфидные связи во всех образцах. Вихрь, спина вниз, и инкубировать образцы при 50 градусах по Цельсию в течение 45 минут. Охладите образцы до комнатной температуры в течение 10 мин. Добавьте йодоацетамид (IAA) к конечной концентрации 50 мМ, чтобы алкилировать снижение остатков. Вихрь, спина вниз, и инкубировать образцы в течение 20 минут при комнатной температуре защищены от света. Сразу же после алкилирования, осаждать протеиновый образец, добавляя 4 тома 100% предварительно охлажденный ацетон и инкубировать при -20 градусов по Цельсию в одночасье. На следующий день, гранулы белка осадок центрифугирования при 16000 х г в течение 10 мин. Вымойте образец гранулы с 90% ацетон, удалить супернатант, и дайте гранулы высохнуть в течение 2-3 мин. Повторно приостановить протеиновые гранулы в 25 мм Tris-HCl (1 мкг/л). Добавить трипсин при окончательном соотношении протеаза к белку 1:50 (w/w) и переварить образцы при 37 градусах Цельсия в одночасье. На следующий день утоляют реакцию пищеварения трипсина, добавляя 5% формической кислоты.ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа LC-MS/MS (шаги 6.1-6.5) требуется минимум 0,5 мкг пептидов на образец. Определить концентрацию пептида образца с помощью количественного анализа глазного пептида (см. Таблицу материалов),как описано в протоколе производителя. 6. Высокопроизводительная жидкая хроматография-тандемная масс-спектрометрия (LC-MS/MS) Используйте следующие фазы LC мобильных: вода в 0.1% FA (A) и ACN в 0.1% FA (B). Загрузите 0,5 мкг пептидов на столбец ловушки (180 мкм и 20 мм), содержащий C18 (5 мкм, 100 евро) и смойте образец 99% растворителя А и 1% B в течение 15 мин при скорости потока 15 л/мин. Отдельные пептиды с использованием штатной упакованной колонки (0,075 мм i.d. и 20 мм) с материалом обратной фазы C18 (5 мкм, 125). Используйте следующий аналитический метод разделения: градиент был перекачивается при 300 нл/мин в течение 120 мин: 0-1 мин, 3% В; 2–90 мин, 10–45% B; 100-105 мин, 100% B; 106–120 мин, 3% Б. Выполняйте сбор данных пептидов в положительном ионном режиме нано-электроспрепи ионизации (nESI) с помощью масс-спектрометра высокого разрешения.ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола была использована ультра-производительность LC (UPLC) инструмент пара с высоким разрешением масс-спектрометр. Использовалось приобретение зависимых данных. Диапазон сканирования м/з для MS1 составлял 3750-1500 при разрешении 60 000 и динамическом исключении 60 с. Ионы с состояниями заряда No1 и Nogt;6 были исключены. Использовалась цель автоматического контроля усиления (AGC) 5.5e5 с максимальным временем впрыска 50 мс и порогом интенсивности 5.5e4. Ионы, отобранные для MS2, подвергались разрозненности столкновения с более высокой энергией (HCD) с использованием 32% нормализованной энергии столкновения. Фрагменты были обнаружены в спектрометре с разрешением 15 000 и целью 5.0e4 AGC. 7. Анализ данных Поиск тандема MS файлов с снизу вверх протеомики анализа программного обеспечения в отношении базы данных C. elegans. Установите параметры поиска анализа белка следующим образом: один трипсин пропустил расщепление, 375-1500 м/з пептидной массы диапазона, допуск массы фрагмента 0,02, и прекурсор массы допуск 10 ppm. Карбамидометилирование устанавливается как статическая модификация и все знают, гидроксил радикальных боковых цепей модификаций9,10 как динамические. Идентификация пептида установлена на 95% уверенности (средний) и остаток на 99% доверия (высокий). Уровень ложного обнаружения (FDR) установлен на уровне 1%. Экспорт данных в электронную базу данных и обобщить степень окисления на пептид или остаток с помощью уравнения ниже11:ПРИМЕЧАНИЕ: Там, где изменена область EIC, извлекается ионная хроматографическая область (EIC) пептида или остатков с окислительной модификацией, а область EIC представляет собой общую площадь того же пептида или остатка с окислительной модификацией и без нее.