In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting voor de studie van eiwitinteracties in Caenorhabditis elegans

1. C. elegans onderhoud en cultuur Groeien en synchroniseren wormen kolonies om hun vierde larven (L4) stadium na standaard laboratoriumprocedures8. De dag van IV-FPOP experiment, was L4 wormen van bacteriële gazons (OP50 E. coli) met M9 buffer (0,02 M KH2PO4, 0,08 M Na2HPO4, 0,08 M NaCl, 1 mM MgSO4). Verkrijg 500 μL aliquots van ~10.000 wormen per IV-FPOP monster. 2. Microfluïdische stroomsysteemmontage Start de montage van het stroomsysteem door een stuk gefluoreerde ethyleenpropyleen (FEP) buizen (1/16 inch buitendiameter (o.d.) x 0,020 in binnendiameter (i.d.)) te snijden. Met behulp van een schone ontleden naald, verwijden de i.d. van de FEP slang om een kleine krater te maken aan de ene kant alleen, ~ 50 mm in lengte. De krater moet groot genoeg zijn om twee 360 μm o.d. stukken gesmolten silica te passen.LET OP: Verbreed het andere uiteinde niet, omdat dit uiteinde alleen wordt gebruikt om de haarvaten van het stopcontact te passen. Snijd met een keramische frees twee stukken van 15 cm van 250 μm i.d. gesmolten silica. Deze twee stukken worden de inbrengende lijnen van het stroomsysteem. Met behulp van zelfklevende tape, tape de twee 250 μm i.d. haarvaten samen ervoor te zorgen dat ze parallel aan elkaar en hun uiteinden zijn 100% gespoeld.OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de gesmolten silicauiteinden niet worden verpletterd na het snijden en recht zijn en 100% tegen elkaar worden gespoeld, wordt aanbevolen om ze te onderzoeken met behulp van een vergrootglas of onder een stereomicroscoop. Steek de twee afgeplakte haarvaten in de handgemaakte krater van de FEP-slang. Duw de haarvaten tot aan de rand van de handgemaakte krater.LET OP: Om de effectiviteit van het stroomsysteem te behouden, duw niet langs de handgemaakte krater (Figuur 1a). Plaats een kleine stip epoxyhars op een schoon oppervlak en meng met een ontledennaald. Plaats snel, met behulp van dezelfde naald, een kleine druppel hars aan het einde van de inbrengende haarvaten waar ze verbinding maken met de FEP-slang en laat de hars drogen, opknoping uitlaat-kant omhoog, voor een paar minuten (Figuur 1a). Terwijl de hars droogt, de FEP-slang en twee haarvaten aan elkaar bindt, snijdt u een nieuwe 250 μm i.d. capillaire. De nieuwe capillaire zal de uitlaat capillair van het stroomsysteem worden. De gewenste lengte van de capillaire kan worden berekend met behulp van de onderstaande vergelijking:Waar l is lengte van de capillaire te snijden in centimeters, t is de gewenste reactietijd in minuten, f is de stroomsnelheid in mL / min, en i.d. is de binnendiameter van de capillaire in centimeters.LET OP: Na het snijden van de uitgang capillair, onderzoeken de uiteinden ervoor te zorgen dat ze recht zijn en niet verpletterd. Zodra de hars is gedroogd, steek de nieuwe capillaire door de FEP buizenuitlaat einde. De uiteinden van de uitgang capillair en de twee inbrengende haarvaten moeten tegen elkaar worden gespoeld in de FEP-slang, dit creëert de meng-T (Figuur 1b). Bind de afvoer capillaire en FEP-slang met verse epoxyhars zoals beschreven in stappen 2.6 en 2.7. Laat de hars ‘s nachts drogen en bind het stroomsysteem aan elkaar. Het microfluïdische stroomsysteem de volgende dag instellen (figuur 1c). 3. Microfluïde stroomsysteem voor in vivo FPOP Steek vier magnetische roerstaafjes in een 5 mL spuit. Deze spuit wordt de monsterspuit. De magnetische roerderen voorkomen dat de wormen zich in de spuit nestelen tijdens IV-FPOP (Figuur 2A). Vul de twee 5 mL spuiten met M9. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in elke spuit als ze kunnen invloed hebben op de debiet en mengefficiëntie. Sluit een Luer-adapter aan op elke 5 mL-spuit, zodat deze vingervast en stevig op hun plaats zit. Bevestig elke spuit aan een enkele 3-2 klep. De spuit moet aan de middelste poort van de klep worden bevestigd(figuur 2B). Zet elke 5 mL spuit vast aan de dubbele spuitpomp en pas de mechanische stopkraag aan om overdruk op de spuit van het duwblok te voorkomen. Houd rekening met de toevoeging van de magnetische roerderen bij het instellen van de stopkraag. Bevestig elke infysaire uiteinde van de zelfgemaakte microfluidic flow systeem aan de bovenste poort van elke 3-2 klep met behulp van een super flensless moer, FEP mouw, en super flensless ferrule (Figuur 2B). Bevestig aan de resterende geopende poort van de 3-2 klep (onderste poort) een 10 cm 450 μm i.d. capillaire met behulp van een super flensloze moer, FEP-hoes en superflangeless ferrule (Figuur 2B). Deze haarvaten worden de terugtrekkende monsterhaarvaten. Start de pompstroom en controleer alle aansluitingen van het microfluïdische stroomsysteem op visuele lekken. Stroom ten minste drie spuitvolumes met behulp van de experimentele stroomsnelheid. De uiteindelijke stroomsnelheid is afhankelijk van het laserstralingsvenster, de laserfrequentie en het volume van de nuluitsluitingsfractie.OPMERKING: Voor dit protocol werd een eindstroomsnelheid van 375,52 μL/min berekend op basis van een laserbestralingsvenster van 2,55 mm, 250 μm i.d. gesmolten silica, nuluitsluitingsfractie en 50 Hz-frequentie. Het stroompad wordt gemarkeerd door de pijlen op de 3-2 klepgreep. Elke spuit kan handmatig worden bijgevuld door de klepgreep van de uitrijpositie naar de terugtrekkende positie te verplaatsen.LET OP: Lekken in de 3-2 klep kunnen worden opgelost door de superflensloze moer opnieuw te schroeven of een van de klepaansluitingen te vervangen (super flensless moer, FEP-hoes of superflangeless ferrule). Lekken bij de meng-T vereisen een hermontage van het microfluïdische stroomsysteem (stappen 2.1 tot en met 2.11). Verplaats het microfluïdische stroomsysteem naar de experimentele bank en zet de afvoercapillaire naar het uitstralende stadium met behulp van een 360 μm o.d. roestvrijstalen unie(figuur 2C,D). Met behulp van een long-reach aansteker, branden de coating van de gesmolten silica op de laser bestraling venster. Reinig de verbrande coating met pluisvrij weefsel en methanol.OPMERKING: Wissel tussen verbrandingscycli en methanolreinigingscycli af om oververhitting van de capillaire werking te voorkomen, omdat overtollige warmte kan smelten en/of de capillaire kan breken. Plaats het magneetroerderblok boven de 5 mL spuit met de magnetische roerderen. Pas de snelheid en positie van het magneetroerderblok aan, zodat de magnetische roerderen in de 5 mL-spuit langzaam en constant draaien. 4. In vivo FPOP Zet de KrF excimer laser aan en laat de thyratron opwarmen.LET OP: De laser zendt zichtbare en onzichtbare straling uit op een golflengte van 248 nm die de ogen kan beschadigen. Een goede oogbescherming moet worden gedragen voordat u de laser inschakelt en het raam van de straaluitgang opent. Meet de laserenergie op een frequentie van 50 Hz voor ten minste 100 pulsen door de optische sensor bij het straaluitgangsvenster te plaatsen.OPMERKING: Voor dit protocol werd een bestralingsvenster van 2,55 mm gebruikt met een laserenergie van 150 ± 2,32 mJ. Verkrijg ongeveer 10.000 wormen (500 μL) en trek het monster handmatig terug in de monsterspuit. Vul de monsterspuit met 2,5 mL M9-buffer voor een eindmonstervolume van 3 mL. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit van het monster worden gebracht. Vul de tweede spuit met 3 mL van 200 mM H2O2,zodat er geen luchtbellen in de spuit worden gebracht. Aan het einde van de uitgangcapillair, plaats een conische buis van 15 mL verpakt in aluminiumfolie met 6 mL van 40 mM N’-Dimethylthiourea (DMTU), 40 mM N-tert-Butyl-α-fenylnitrone (PBN) en 1% dimethylsulfoxide om overtollige H2O2, hydroradicalen xyl xyl en rem te doven methioninesulfoxide reductaseactiviteit. Start de excimerlaser vanuit het softwarevenster, wacht op de eerste puls en start de monsterstroom van de dubbele spuit.OPMERKING: Monsters moeten worden uitgevoerd in biologische duplicaten in technische drievoud onder 3 monsteromstandigheden: laserbestraling met H 2O2 (monster), geen laserbestraling met H2O2 en geen laserbestraling nr.2 Verzamel het hele monster in de buis van 15 mL, terwijl actief de monsterstroom wordt gecontroleerd op visuele lekken, omdat sommige tegendruk van de monsterspuit zich soms kan ophopen. Na IV-FPOP voegen pelletwormen door centrifugering bij 805 x g gedurende 2 min. Verwijder de blusoplossing, voeg 250 μL lysisbuffer toe (8 M urea, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride [PMSF]). Breng het monster over op een schone microcentrifugebuis, vriesvast en bewaar op -80 °C tot de spijsvertering van het monster. 5. Eiwitextractie, zuivering en proteolyse Ontdooi bevroren monsters op ijs en homogeniseer door middel van sonicatie voor 10 s, gevolgd door een 60 s ijs incubatie. Er kunnen meerdere geluidsrondes nodig zijn, homogenaat kan onder een stereomicroscoop worden waargenomen door een monster van 2 μL op een microscoopplaat te plaatsen. Monsterhomogenisatie is voltooid wanneer kleine tot geen stukjes wormen worden gezien. Centrifugeer gehomogeniseerde wormen op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C en verzamel de supernatant in een schone microcentrifugebuis. Bepaal de eiwitconcentraties in monsters met behulp van een bicinchoninezuurtest (BCA-test) met behulp van de instructies van de fabrikant.OPMERKING: De monsterconcentratie kan worden bepaald met behulp van een biochemische eiwitconcentratietest naar keuze. Houd rekening met reagenscompatibiliteit met lysisbuffer (8 M urea, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). Bovendien kan een bufferverdunning nodig zijn. Verkrijg 100 μg eiwit uit elk monster en plaats in schone microcentrifugebuizen. Voeg dithiothreitol (DTT) toe aan een eindconcentratie van 10 mM om disulfidebindingen in alle monsters te verminderen. Vortex, spin naar beneden, en incuberen monsters op 50 °C gedurende 45 min. Koel monsters tot kamertemperatuur gedurende 10 min. Voeg iodoacetamide (IAA) toe aan een uiteindelijke concentratie van 50 mm om minder residuen te alkyleren. Vortex, spin naar beneden, en incubeer monsters voor 20 min bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Onmiddellijk na de alkylation, neerslaan het eiwitmonster door het toevoegen van 4 volumes van 100% voorgekoelde aceton en incubeerbij -20 °C ‘s nachts. De volgende dag, pellet eiwit neerslag door centrifugering op 16.000 x g voor 10 min. Wash monster pellet met 90% aceton, verwijder supernatant, en laat pellet te drogen voor 2-3 min. Schort de eiwitpellet opnieuw op in 25 mM Tris-HCl (1 μg/μL). Voeg trypsine toe bij een laatste protease-eiwitverhouding van 1:50 (w/w) en verteer monsters bij 37 °C ‘s nachts. De volgende dag doven de trypsin ederreactie door het toevoegen van 5% mierenzuur.OPMERKING: Voor LC-MS/MS-analyse (stappen 6.1-6.5) is minimaal 0,5 μg peptiden per monster nodig. Bepaal de peptideconcentraties van het monster met behulp van een kwantitatieve colorimetrische peptidetest (zie de materiaaltabel),zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. 6. Krachtige vloeibare chromatografie-tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS) Gebruik de volgende LC mobiele fasen: water in 0,1% FA (A) en ACN in 0,1% FA (B). Laad 0,5 μg peptiden op een valkolom (180 μm × 20 mm) met C18 (5 μm, 100 Å) en was monster met 99% oplosmiddel A en 1% B voor 15 min bij 15 μL/min debiet. Afzonderlijke peptiden met behulp van een in-house verpakte kolom (0,075 mm i.d. × 20 mm) met C18 omgekeerde fase materiaal (5 μm, 125 Å). Gebruik de volgende analysescheidingsmethode: de helling werd gepompt op 300 nL/min gedurende 120 min: 0−1 min, 3% B; 2−90 min, 10−45% B; 100−105 min, 100% B; 106−120 min, 3% B. Gegevensverwerving van peptiden uitvoeren in positieve ionenmodus nano-elektrospray ionisatie (nESI) met behulp van een hoge resolutie massaspectrometer.OPMERKING: Voor dit protocol werd gebruik gemaakt van een ultra-performance LC (UPLC) instrument koppel aan een hoge resolutie massaspectrometer. Gegevensafhankelijke acquisitie werd gebruikt. De m/z-scanbereik voor MS1 was 3750-1500 bij een resolutie van 60.000 en 60 s dynamische uitsluiting. Ionen met kostenstatussen van +1 en >6 zijn uitgesloten. Een automatische gain control (AGC) doelstelling van 5.5e5 werd gebruikt met een maximale injectietijd van 50 ms en een intensiteitsdrempel van 5,5e4. Ionen geselecteerd voor MS2 werden onderworpen aan een hogere energie collisional dissociatie (HCD) fragmentatie met behulp van 32% genormaliseerde botsing energie. Fragmentionen werden gedetecteerd in de spectrometer met 15.000 resolutie en een 5.0e4 AGC doel. 7. Gegevensanalyse Zoek tandem MS-bestanden met een bottom-up proteomics analyse software tegen de C. elegans database. Stel de eiwitanalyse zoekparameters als volgt: een trypsine gemist decolleté, 375-1500 m / z peptide massa bereik, fragment massa tolerantie van 0,02, en voorloper massa tolerantie van 10 ppm. Carbamidomethylatie is ingesteld als een statische modificatie en alle weten hydroxyl radicale side-chain modificaties9,10 als dynamisch. Peptide identificatie wordt vastgesteld op 95% vertrouwen (medium) en residu op 99% vertrouwen (hoog). Het foute detectiepercentage (FDR) is vastgesteld op 1%. Gegevens exporteren naar een elektronische database en de omvang van de oxidatie per peptide of residu samenvatten met behulp van de vergelijking onder11:OPMERKING: Wanneer het eic-gebied gewijzigd is, is het geëxtraheerde ionchromatografische gebied (EIC) van het peptide of residu met een oxidatieve wijziging, en het EIC-gebied is het totale gebied van hetzelfde peptide of residu met en zonder oxidatieve wijziging.