체노하브디염 예쁜꼬마선충의 단백질 상호작용 연구를 위한 생체내 하이드록실 라디칼 단백질 발자국

1. C. 예쁜꼬마선충 유지 보수 및 문화 성장하고 표준 실험실 절차 다음 자신의 네 번째 애벌레 (L4) 단계에 벌레 식민지를 동기화8. IV-FPOP 실험의 날, M9 완충액(0.02 M KH2PO 4, 0.08 M Na 2 HPO4,0.08 MNa2HPO4,0.08 M NaCl, 1 MM MgSO4)으로세균성 잔디(OP50 대장균)로부터L4 웜을 세척한다. IV-FPOP 샘플당 ~10,000개의 웜의 500 μL aliquots를 얻습니다. 2. 미세 유체 흐름 시스템 어셈블리 불소 에틸렌 프로필렌(FEP) 튜브(1/16in) 외경(o.d.) x 0.020 in. 내경(i.d.))의 2cm 조각을 절단하여 유동 시스템 조립을 시작합니다. 깨끗한 해부 바늘을 사용하여 FEP 튜브의 i.d.를 넓히면 한쪽 끝에서만 작은 분화구를 만들기 위해 ~ 50mm 길이로 만듭니다. 분화구는 융합 된 실리카 의 두 360 μm o.d. 조각에 맞게 충분히 커야한다.참고: 이 끝은 출구 모세관에 맞게만 사용되기 때문에 반대쪽 끝을 넓이지 마십시오. 세라믹 커터로 250 μm 즉, 융합 실리카의 두 15cm 조각을 잘라. 이 두 조각은 흐름 시스템의 주입 라인이 될 것입니다. 자체 점착 테이프를 사용하여 250 μm 즉, 모세 혈관을 서로 평행하게 하고 끝이 100% 플러시되도록 테이프를 붙입니다.참고: 융합된 실리카 끝이 절단 후 분쇄되지 않고 직선이고 100% 서로 플러시되도록 하려면 돋보기 또는 스테레오 현미경으로 검사하는 것이 좋습니다. 두 개의 테이핑된 모세혈관을 FEP 튜브의 수제 분화구에 삽입합니다. 모세 혈관을 수제 분화구의 가장자리까지 밀어 넣습니다.주의: 유량 시스템의 효능을 유지하기 위해 수제 분화구를 지나밀어두지마십시오(그림 1a). 깨끗한 표면에 에폭시 수지의 작은 점을 놓고 해부 바늘과 혼합. 신속하게 동일한 바늘을 사용하여 FEP 튜브와 연결하고 수지가 몇 분 동안 콘센트 쪽을 위로 매달려 건조 할 수있는 주입 모세 혈관의 끝에 작은 수지 한 방울을 놓습니다(그림 1a). 수지가 건조하는 동안, FEP 튜브와 두 개의 모세 혈관을 결합, 새로운 250 μm 즉, 모세관을 잘라. 새로운 모세관은 유동 계통의 출구 모세관이 될 것입니다. 모세관의 원하는 길이는 아래 방정식을 사용하여 계산할 수 있습니다.l이 센티미터로 절단되는 모세관의 길이인 경우, t는 분에서 원하는 반응 시간, f는 mL/min의 유속이고, i.d.는 센티미터의 모세관의 내경이다.참고: 출구 모세관을 절단한 후 끝이 곧고 부서지지 않도록 검사합니다. 수지가 건조되면 FEP 튜브 배출구 끝을 통해 새로운 모세관을 삽입합니다. 출구 모세관의 내부 말단과 두 주입 모세관은 FEP 튜브 내부에서 서로 플러시되어야하며, 이것은 혼합-T(도 1b)를생성한다. 2.6 단계 및 2.7단계에서 설명된 바와 같이 출구 모세관 및 FEP 튜브를 신선한 에폭시 수지와 결합합니다. 수지가 유동 계통을 함께 결합하여 하룻밤 동안 건조시키십시오. 다음날 미세유체 유동 시스템을 설정합니다(그림1c). 3. 생체 내 FPOP용 미세 유체 흐름 시스템 5mL 주사기 1개에 4개의 자기 교반기를 삽입합니다. 이 주사기는 샘플 주사기가됩니다. 마그네틱 교반기는 IV-FPOP(그림2A)동안주사기 내부에 벌레가 침전되는 것을 방지합니다. M9로 두 개의 5mL 주사기를 채웁니다. 각 주사기 내부에 유속 및 혼합 효율에 영향을 줄 수 있는 기포가 없는지 확인합니다. Luer 어댑터를 각 5mL 주사기에 연결하여 손가락이 단단하고 제자리에 고정되도록 합니다. 각 주사기를 단일 3-2 밸브에 부착합니다. 주사기는 밸브의 중간 포트에 부착해야합니다(그림 2B). 각 5mL 주사기를 듀얼 주사기 펌프에 고정하고 기계식 스톱 칼라를 조정하여 푸셔 블록에서 주사기에 대한 과압을 방지합니다. 스톱 칼라를 설정할 때 마그네틱 스터러를 추가하십시오. 수제 미세 유체 유량 계통의 각 주입 모세관 단부는 슈퍼 플란체 너트, FEP 슬리브 및 슈퍼 플란체 페룰을 사용하여 각 3-2 밸브의 상단 포트에 부착합니다(그림2B). 3-2 밸브(하단 포트)의 나머지 개방된 포트에, 10 cm 450 μm i.d. 모세관을 슈퍼 플랑체 너트, FEP 슬리브 및 슈퍼 플랑체 페룰을 사용하여 부착한다(도2B). 이 모세 혈관은 철회 견본 모세 혈관이 됩니다. 펌프 흐름을 시작하고 미세 유체 유량 시스템의 모든 연결부에서 시각적 누출을 확인합니다. 실험 유량을 사용하여 적어도 3개의 주사기 부피를 흐르게 한다. 최종 유량은 레이저 조사 창, 레이저 주파수 및 제로 배제 분획 체적에 따라 달라집니다.참고: 이 프로토콜의 경우, 375.52 μL/min의 최종 유량은 2.55 mm, 250 μm i.d. 융합 실리카, 제로 배제 분획 및 50 Hz 주파수의 레이저 조사 창에서 계산되었습니다. 유동 경로는 3-2 밸브 핸들의 화살표로 표시됩니다. 각 주사기는 밸브 핸들을 추방 위치에서 인출 위치로 이동하여 수동으로 리필할 수 있습니다.참고: 3-2 밸브의 누출은 슈퍼 플란소 너트를 다시 나사로 조이거나 밸브 연결부(슈퍼 플란젤 너트, FEP 슬리브 또는 슈퍼 플랑글레스 페룰)를 교체하여 고정할 수 있습니다. 혼합-T에서의 누수는 미세 유체 유동 시스템의 재조립이 필요합니다(단계 2.1 ~ 2.11). 미세 유체 흐름 시스템을 실험 벤치로 옮기고 360 μm 의 스테인레스 스틸 유니온을 사용하여 방사 단계에 출구 모세관을 고정합니다(그림 2C,D). 긴 리치 라이터를 사용하여 레이저 조사 창에서 융합 실리카 코팅을 구울 수 있습니다. 보풀이없는 조직과 메탄올을 사용하여 연소 된 코팅을 청소하십시오.참고: 과도한 열이 모세관을 녹이거나 파손할 수 있기 때문에 모세관을 과열하지 않도록 연소 주기와 메탄올 세척 주기를 번갈아 가며 피하십시오. 자기 교반기를 포함하는 5 mL 주사기 위에 자기 교반기 블록을 놓습니다. 5mL 주사기 내부의 자기 교반기가 천천히 그리고 지속적으로 회전되도록 자기 교반기 블록의 속도와 위치를 조정합니다. 4. 생체 내 FPOP KrF 엑시머 레이저를 켜고 티라트론이 워밍업되도록 합니다.주의: 레이저는 눈을 손상시킬 수 있는 248nm 파장에서 가시광선과 보이지 않는 방사선을 방출합니다. 레이저를 켜고 빔 출구 창을 열기 전에 적절한 눈 보호 기능을 착용해야 합니다. 빔 출구 창에 광학 센서를 배치하여 최소 100펄스동안 50Hz의 주파수에서 레이저 에너지를 측정합니다.참고: 이 프로토콜의 경우, 150±2.32 mJ의 레이저 에너지와 함께 2.55 mm 조사 창을 사용하였다. 약 10,000개의 웜(500 μL)을 얻고 샘플을 샘플 주사기로 수동으로 인출합니다. 3 mL의 최종 샘플 볼륨에 대한 M9 버퍼의 2.5 mL로 샘플 주사기를 채웁니다. 샘플 주사기에 기포가 유입되지 않았는지 확인합니다. 200 mM H2O2의3 mL로 두 번째 주사기를 채우고 다시 주사기에 기포가 유입되지 않도록하십시오. 출구 모세관의 끝에, 40 mM N’-Dimethylthiourea (DMTU), 40 mM N-tert-α-phenylnitrone (PBN) 및 1 % 디메틸 설옥사이드 를 포함하는 알루미늄 호일에 싸여 15 mL 원추형 튜브를 배치, 과잉 H2O, 라디악을 담급질 수로, 라디칼2O. 메티오닌 설폭사이드 환원효소 활성을 각각 억제한다. 소프트웨어 창에서 엑시머 레이저를 시작하고 첫 번째 펄스를 기다린 다음 이중 주사기에서 샘플 흐름을 시작합니다.참고 : 샘플은 3 샘플 조건하에서 생물학적 중복으로 실행되어야합니다 : H2O2 (샘플)를 사용한 레이저 조사, H2O2를 사용한 레이저 조사 없음 및 레이저 조사 없음 H2O2 (컨트롤), 생물학적 세트 당 9 개의 샘플로 합산됩니다. 15 mL 튜브에서 전체 샘플을 수집하는 동시에 시료 주사기의 일부 배압이 때때로 축적될 수 있기 때문에 시각적 누출에 대한 샘플 흐름을 능동적으로 모니터링합니다. IV-FPOP에 이어, 805 x g에서 원심분리에 의한 펠릿 웜을 2분 동안 2분 동안 담금질 용액을 제거하고, 용해 완충액 250 μL(8M 우레아, 0.5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EDTA, 1 mm 페닐틸설론 플루오라이드)을 추가한다. 샘플을 깨끗한 미세원심지 튜브로 옮기고, 플래시 동결하고, 시료가 소화될 때까지 -80°C에서 보관한다. 5. 단백질 추출, 정제 및 단백질 용해 얼음에 냉동 샘플을 해동하고 10 초 동안 초음파 처리로 균질화한 다음 60 초의 얼음 배양을 합니다. 초음파 처리의 다중 라운드가 요구될 수 있고, 균질은 현미경 슬라이드에 2 μL 샘플 aliquot를 배치하여 입체 현미경 하에서 관찰될 수 있다. 샘플 균질화는 작은 벌레 조각이 보이지 않는 경우 완료됩니다. 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 균질화된 웜을 깨끗한 미세원심지 튜브로 포집한다. 제조업체의 지침을 사용하여 비신콘닌산 분석법(BCA 분석)을 사용하여 샘플 단백질 농도를 결정합니다.참고: 시료 농도는 임의의 생화학적 단백질 농도 분석측정을 사용하여 결정될 수 있다. 용해 완충제 (8 M 요소, 0.5 % SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF)와의 시약 호환성을 염두에 두십시오. 또한 버퍼 희석이 필요할 수 있습니다. 각 샘플에서 100 μg의 단백질을 얻고 깨끗한 미세 원심 분리튜브에 놓습니다. 디티오트레이톨(DTT)을 10 mM 최종 농도에 첨가하여 모든 시료에서 이황화 결합을 감소시소. 소용돌이, 스핀다운, 50°C에서 45분 동안 시료를 배양한다. 샘플을 실온으로 10분 동안 식힙니다. 이오도아세타미드(IAA)를 50 mM 의 최종 농도에 추가하여 감소된 잔기를 알킬레이트합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 소용돌이, 스핀다운 및 20분 동안 샘플을 배양합니다. 알킬화 직후, 100% 미리 냉각된 아세톤의 4부량을 첨가하여 단백질 샘플을 침전시키고 -20°C에서 밤새 배양한다. 다음날, 펠릿 단백질은 10분 동안 16,000 x g에서 원심분리하여 침전합니다. 단백질 펠릿을 25 mM Tris-HCl (1 μg/μL)에 다시 일시 중단합니다. 마지막 프로테아제에서 1:50(w/w)의 단백질 비에 트립신을 넣고 밤새 37°C에서 샘플을 소화합니다. 다음날 5% 포산산을 첨가하여 트립신 소화 반응을 담금질한다.참고: LC-MS/MS 분석(단계 6.1-6.5)에는 샘플당 최소 0.5 μg의 펩티드가 필요합니다. 제조업체의 프로토콜에 의해 설명된 바와 같이 정량적 배색 펩티드 분석법(재료 표참조)을 사용하여 샘플 펩티드 농도를 결정합니다. 6. 고성능 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS) 다음 LC 이월 단계를 사용하십시오: 0.1% FA(A)의 물 과 0.1% FA(B)에서 ACN. 0.5 μg의 펩티드를 C18(5 μm, 100 Å)을 함유한 트랩 컬럼(180 μm × 20mm)에 적재하고 15 μL/min 유량에서 99% 용매 A 및 1% B로 시료를 세척합니다. C18 역상 물질(5 μm, 125 Å)을 가진 사내 포장 컬럼(0.075 mm i.d. × 20 mm)을 사용하여 분리된 펩타이드. 다음 분석 분리 방법을 사용: 그라데이션은 120 분 동안 300 nL / min에서 펌핑되었다 : 0-1 분, 3 % B; 2-90 분, 10-45 % B; 100-105 분, 100 % B; 106-120 분, 3 % B. 고분해능 질량 분석계를 사용하여 양성 이온 모드 나노 전기 분무 이온화(nESI)에서 펩타이드의 데이터 수집을 수행합니다.참고: 이 프로토콜의 경우 고해상도 질량 분석기와 초고성능 LC(UPLC) 계측기 커플을 활용했습니다. 데이터 종속 수집이 활용되었습니다. MS1의 m/z 스캔 범위는 60,000 해상도에서 3750-1500이고 60s 동적 제외입니다. 충전 상태가 +1 및 >6인 이온은 제외되었습니다. 5.5e5의 자동 게인 제어(AGC) 타겟을 최대 주입 시간 50ms및 강도 임계값 5.5e4로 사용하였다. MS2에 대해 선택된 이온은 32% 정규화된 충돌 에너지를 사용하여 고에너지 충돌 해리(HCD) 단편화를 행하였다. 분광계에서 15,000개의 분해능과 5.0e4 AGC 표적을 가진 이온이 검출되었습니다. 7. 데이터 분석 C. elegans 데이터베이스에 대한 상향식 프로테오믹스 분석 소프트웨어와 함께 MS 파일을 검색합니다. 다음과 같이 단백질 분석 검색 매개 변수를 설정: 하나의 트립신 놓친 절단, 375-1500 m/z 펩티드 질량 범위, 0.02의 단편 질량 허용 오차, 10 ppm의 전구체 질량 허용 오차. 카르바미도메틸화는 정적 변형으로 설정되고 모두 하이드록실 라디칼 측체인 변형9,,10을 동적으로 알고 있다. 펩타이드 식별은 95% 신뢰도(중간) 및 잔류물 99% 신뢰도(높음)로 확립됩니다. 거짓 발견 률(FDR)은 1%로 설정됩니다. 전자 데이터베이스로 데이터를 내보내고11이하의 방정식을 사용하여 펩타이드 또는 잔류물당 산화 정도를 요약합니다.참고: EIC 영역이 변형된 경우 산화 변형을 가진 펩티드 또는 잔기의 추출된 이온 크로마토그래피 영역(EIC)이며, EIC 영역은 산화 변형유무에 관계없이 동일한 펩티드 또는 잔기의 총 면적이다.