ב Vivo הידרוקסיל חלבון רדיקלי מדפיס הדפסה לחקר אינטראקציות חלבונים באלבוראבאבדיטיס האלאים

1. ס. אלאנים תחזוקה ותרבות הגדל וסנכרן מושבות תולעים לזחלים הרביעי שלהם (L4) בעקבות הליכים מעבדתיים סטנדרטיים8. היום של הניסוי IV-FPOP, לשטוף תולעים L4 ממדשאות בקטריאלי (OP50 E. coli) עם M9 מאגר (0.02 M KH2PO4, 0.08 M Na2Hpo4, 0.08 m הנאל, 1 מ”מ mgso 4).4 השג 500 μL של ~ 10,000 בדיקת תולעים לכל IV-FPOP לדוגמה. 2. מערכת זרימה מיקרופלואידיג הפעל את מערכת הזרימה הרכבה על ידי גזירה של 2 ס מ פיסת פרופילן אתילן מחולק (FEP) צינורות (1/16 בתוך. קוטר חיצוני (מנת יתר) x 0.020 ב. קוטר פנימי (זיהוי)). באמצעות המחט ניקוי נקי, להרחיב את הזהות של אבובים FEP כדי ליצור מכתש קטן בקצה אחד בלבד, ~ 50 mm אורך. המכתש צריך להיות גדול מספיק כדי להתאים 2 360 יקרומטר פיסות של סיליקה מותך.הערה: אין להרחיב את הקצה הנגדי מכיוון שקצה זה ישמש רק להתאמת נימי השקע. עם חותך קרמי, גזור 2 15 ס מ חתיכות של 250 יקרומטר לזהות התמזגו סיליקה. שתי היצירות הללו יהפכו לקווי הפיזור של מערכת הזרימה. באמצעות הדבקה עצמית, הקלטת את נימי הזיהוי של 2 250 יקרומטר יחד ומבטיחים שהם מקבילים זה לזה והקצוות שלהם הם 100%.הערה: כדי להבטיח את הקצוות סיליקה התמזגו לא נמחץ לאחר חיתוך, ו הם ישרים ו 100% הסמיק אחד נגד השני, מומלץ לבדוק אותם באמצעות זכוכית מגדלת או תחת מיקרוסקופ סטריאו. הכנס את שני נימים מודבק למכתש בעבודת יד של אבובים FEP. דחפו את הנימים עד לקצה של המכתש בעבודת יד.התראה: כדי לשמור על יעילות מערכת הזרימה, אל תדחף את הלוע מעבר למכתש עבודת-יד (איור 1a). מניחים נקודה קטנה של שרף אפוקסי על משטח נקי ומערבבים עם מחט מבתר. במהירות, באמצעות המחט זהה, מניחים טיפה קטנה של שרף בסוף נימים לפיזור שבו הם מתחברים עם אבובים FEP ולאפשר שרף להתייבש, תלוי לשקע-בצד למעלה, במשך כמה דקות (איור 1a). בעוד שרף מתייבש, קשירה צינורות fep ושני נימים יחד, לחתוך חדש 250 יקרומטר זיהוי נימי. הקפילר החדש יהפוך. לנימי הזרם של מערכת הזרימה ניתן לחשב את האורך הרצוי של הנימים באמצעות המשוואה הבאה:כאשר אני אורך של נימי להיות חתוך בסנטימטרים, t הוא זמן התגובה הרצוי בדקות, f הוא שיעור הזרימה mL/min, ו-זיהוי הוא הקוטר הפנימי של נימי בסנטימטרים.הערה: לאחר חיתוך נימי השקע, בדוק את הקצוות המבטיחים שהם ישרים ולא מרוסקים. לאחר שרף יש מיובש, להכניס את נימי חדש דרך הקצה לשקע FEP צינור. החלק הפנימי של נימי שקע ושני נימי המים צריכים להיות מיושרים זה נגד זה בתוך אבובים FEP, זה יוצר את ערבוב T (איור 1b). אגד את נימי שקע ו FEP אבובים עם שרף אפוקסי טרי כפי שמתואר בשלבים 2.6 ו 2.7. הניחו לשרף היבש לאגד את מערכת הזרימה יחד. הגדר את מערכת הזרימה המיקרופלואידיג למחרת (איור 1c). 3. מערכת זרימה מיקרופלואידיג בvivo FPOP הכנס 4 משטירים מגנטיים בתוך 5 מזרק mL. מזרק זה הופך למזרק לדוגמה. הרימרים המגנטיים מונעים מהתולעים להתיישב בתוך המזרק במהלך IV-FPOP (איור 2A). מלא את שני 5 מ”ל מזרקים עם M9. ודא כי אין בועות אוויר בתוך כל מזרק כפי שהם יכולים להשפיע על קצב הזרימה ואת היעילות ערבוב. חבר מתאם Luer לכל מזרק 5 mL ומבטיח שהם צמודים ומאובטחים במקומם. . חברו כל מזרק לשסתום 3-2 אחד המזרק צריך להיות מוצמד ליציאה האמצעית של השסתום (איור 2B). Secure כל מזרק ל 5 מ ל למשאבת מזרק כפול ולהתאים את הצווארון לעצור מכני כדי למנוע את הלחץ על המזרק מבלוק דוחס. זכור את התוספת של השטירים המגנטיים בעת הגדרת הצווארון לעצור. לצרף כל הקצה נימי מערכת זרימת מיקרופלואידיג תוצרת בית לנמל העליון של כל שסתום 3-2 באמצעות אגוז ללא מוצא סופר, FEP שרוול, ו ferang, ללאהחלקה (איור 2B). ליציאה שנותרה פתוחה של שסתום 3-2 (הנמל התחתון), לצרף 10 ס מ 450 יקרומטר זיהוי נימי באמצעות אגוז ללא כמות סופר, שרוול fep, ו-סופר flangelessהחלקה (איור 2b). נימים אלה הופכים לנימים לדוגמה הנסוגים. הפעל את זרימת המשאבה ובדוק את כל החיבורים של מערכת הזרימה המיקרופלואידיג לדליפות חזותיות. זרימה לפחות שלושה אמצעי אחסון באמצעות קצב הזרימה הנסיוני. שיעור הזרימה הסופי תלוי בחלון הקרנה של לייזר, בתדר לייזר ובאמצעי אחסון שבריר של אפס-הכללה.הערה: עבור פרוטוקול זה, קצב הזרימה הסופי של 375.52 μl/min חושב מחלון הקרנה לייזר של 2.55 מ”מ, 250 יקרומטר זיהוי התמזגו סיליקה, אפס שבר הדרה, ו 50 תדירות Hz. נתיב הזרימה מסומן על-ידי החיצים בנקודת האחיזה לשסתום 3-2. כל מזרק יכול להיות ממולא ידנית על ידי הזזת ידית השסתום מהמיקום הגירוש לתנוחת הנסיגה.הערה: הדלפות על שסתום 3-2 יכול להיות קבוע על ידי התעסקות מחדש את האגוז חסר הנעל סופר או להחליף את כל החיבורים שסתומים (אגוז בלתי מסודר במיוחד, FEP שרוול, או שלטון סופר האור). הדלפות על ערבוב-T דורשים הרכבה של מערכת הזרימה microflu, מיקרופלואידיג (שלבים 2.1 עד 2.11). להעביר את מערכת הזרימה microflu, מיקרופלואידים לספסל ניסיוני ולאבטח את משקע החשמל לשלב מקרין באמצעות 360 יקרומטר מנת יתר פלדת אל-חלד (איור 2C, d). באמצעות מצית לטווח ארוך, לצרוב את הציפוי של סיליקה התמזגו בחלון הקרנה לייזר. נקו את הציפוי הצרוב בעזרת רקמה נטולת סיבים ומתנול.הערה: לסירוגין בין מחזורי שריפת ומחזורי ניקוי מתנול כדי למנוע חימום יתר את הנימי כמו חום עודף יכול להמיס ו/או לשבור את הנימים. מקמו את גוש הניצנים המגנטי מעל מזרק 5 מ ל המכיל את הרימרים המגנטיים. כוונן את המהירות והמיקום של בלוק הטירר המגנטי כך שהבלדרים המגנטיים בתוך 5 מזרק mL מסתובבים לאט ובהתמדה. 4. ב vivo FPOP הפעל את לייזר KrF excimer ולאפשר לתיראטרון להתחמם.התראה: הלייזר פולט קרינה גלויה ובלתי נראית ב248-גל ננומטר שיכול לפגוע בעיניים. יש לענוד את הגנת העין הנכונה לפני הפעלת הלייזר ופתיחת חלון יציאת הקרן. מדוד את אנרגיית הלייזר בתדר של 50 הרץ לפחות 100 פולסים על ידי הצבת החיישן האופטי בחלון יציאת הקרן.הערה: עבור פרוטוקול זה, חלון 2.55 מ”מ הקרנה בשימוש עם אנרגיית לייזר של 150 ± 2.32 mJ. השג approximatively 10,000 תולעים (500 μL) ולמשוך באופן ידני את המדגם לתוך המזרק לדוגמה. למלא את המזרק לדוגמה עם 2.5 mL של מאגר M9 עבור נפח המדגם הסופי של 3 מ ל. ודא כי לא מוצגים בועות אוויר לתוך המזרק לדוגמה. למלא את המזרק השני עם 3 מ מ של 200 mM H2O2, שוב להבטיח לא בועות אוויר מוצגים לתוך המזרק. בסופו של משקע outlet, מניחים צינור 15 מ ל חרוט עטוף ברדיד אלומיניום המכיל 6 מ מ של 40 מ”מ N’-Diמתילתיואוראה (DMTU), 40 מ”מ N-tert-בוטיל-α-פנילטין (PBN), ו 1% diמתיל סולפוקסיד כדי להרוות עודף H2O2, רדיקלים הידרוקסיל, ולעכב את מתיונין סולפוקסיד רדוקטאז פעילות, בהתאמה. הפעל את לייזר excimer מחלון התוכנה, לחכות הדופק הראשון, ולהתחיל את זרימת לדוגמה ממזרק כפול.הערה: יש להפעיל דגימות בכפילויות ביולוגיות בטריפליטים טכניים תחת 3 דוגמאות: הקרנה לייזר עם H2o2 (דוגמה),אין הקרנה לייזר עם h2o 2 וללא הקרנה לייזר לא H2o2 (שולטת), בהיקף של 9 דגימות לכל ערכה ביולוגית. לאסוף את המדגם כולו 15 מ”ל שפופרת, בעוד באופן פעיל ניטור זרימת לדוגמה עבור כל הדלפות חזותיים כמו בלחץ האחורי כמה מזרק לדוגמה יכול לפעמים לבנות. בעקבות IV-FPOP, גלולה תולעים על ידי צנטריפוגה ב 805 x g עבור 2 דקות. להסיר פתרון כיבוי, להוסיף 250 μl של מאגר הליזה (8 M אוריאה, 0.5% sds, 50 MM hepes, 50 מ”מ הנאל, 1 מ”מ edta, 1 מ”מ פנילמתיל פלופקסיל [PMSF]). העבר את הדגימה לשפופרת מיקרוצנטריפוגה נקיה, הקפא הבזק ואחסן בשעה-80 ° צ’ עד לדגימת העיכול. 5. הפקת חלבון, טיהור והפרוטפוליזיס הפשרת דגימות קפואות על קרח והומוגון על ידי sonication עבור 10 s, ואחריו הדגירה של 60 s קרח. סיבובים מרובים של sonication עשויים להידרש, הומואכל ניתן לצפות תחת stereomicroscope על ידי הצבת 2 μl לדוגמה סדרת מחלקים בשקופית מיקרוסקופ. לדוגמה הומוגון מלאה כאשר לא נראים חתיכות קטנות של תולעים. צנטריפוגה הומוגניים תולעים ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° צ’ ולאסוף את supernatant לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי. קביעת ריכוזי חלבון לדוגמה באמצעות שיטת החומצה הבינותית (שיטת BCA) באמצעות הוראות היצרן.הערה: ניתן לקבוע ריכוז לדוגמה בעזרת כל החלטה של ריכוז חלבון ביוכימיים. זכור תאימות מגיב עם מאגר הליזה (8 שתנן M, 0.5% SDS, 50 מ”מ HEPES, 50 mM הנאקל, 1 מ”מ EDTA, 1 מ”מ PMSF). בנוסף, ייתכן שיהיה צורך בדילול מאגר. השג 100 μg של חלבון מכל מדגם ומקום בצינורות מיקרוצנטריפוגה נקיים. הוסף dithiothreitol (DTT) לריכוז הסופי של 10 מ”מ כדי להפחית את איגרות החוב הדיסולניות בכל הדגימות. מערבולת, ספין למטה, ו הדגירה דגימות ב 50 ° c עבור 45 דקות. דגימות מגניבות לטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. הוספת יודרחאמיד (רשות העתיקות) לריכוז סופי של 50 מ”מ כדי לקבל שאריות מופחתת באיחור. מערבולת, ספין למטה, ו הדגירה דגימות עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. מיד לאחר האלקיללציה, מזרז את דגימת החלבון על-ידי הוספת 4 כרכים של 100% אצטון מקורר ו-דגירה ב-20 ° c בלילה. למחרת, החלבון גלולה מזרז על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 10 דקות לשטוף את הגלולה לדוגמה עם 90% אצטון, להסיר supernatant, ולאפשר גלולה יבש עבור 2 – 3 דקות. מחדש להשעות את כדור החלבון ב 25 מילימטר טריס-HCl (1 μg/μL). הוסיפו טריפסין בפרוטאז האחרון ליחס החלבונים של 1:50 (w/w) ולעכל דגימות ב 37 ° c למשך הלילה. ביום שלמחרת, כיבוי הטריפסין תגובת העיכול על ידי הוספת 5% חומצה פורמית.הערה: מינימום של 0.5 μg של פפטידים לכל מדגם נדרש עבור ניתוח LC-MS/MS (שלבים 6.1-6.5). קביעת ריכוזי פפטיד לדוגמה באמצעות שיטת הצביעה הכמותית (עיין בטבלת החומרים) כפי שמתואר בפרוטוקול היצרן. 6. ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית-טנדם המסה (LC-MS/MS) השתמש בשלבים הבאים של LC mobile: מים ב 0.1% הפא (A) ו-ACN ב-0.1% FA (ב). טעינת 0.5 μg של פפטידים על עמודת השמנה (180 יקרומטר × 20 מ”מ) המכיל סי18 (5 יקרומטר, 100 Å) ולשטוף את המדגם עם 99% ממס a ו-1% B עבור 15 דקות בשיעור 15 μl/דקות. פפטידים נפרדים באמצעות עמודה ארוזה בתוך הבית (0.075 מ”מ זיהוי × 20 מ”מ) עם סי18 השלב הפוכה חומר (5 μm, 125 Å). השתמש בשיטת ההפרדה האנליטית הבאה: מעבר הצבע נשאב ב-300 nL/min עבור 120 דקות: 0 כ 1 דקות, 3% B; 2-90 דקות, 10-45% B; 100-105 דקות, 100% B; 106-120 דק ‘, 3% ב לבצע רכישת נתונים של פפטידים במצב יון חיובי ננו-electrospray יינון (nesi) באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה.הערה: עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש בכלי מכשיר LC ביצועים אולטרה-משתמשים לספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה. נעשה שימוש ברכישה תלוית נתונים. טווח הסריקה m/z עבור MS1 היה 3750 – 1500 ב 60,000 רזולוציה ו-60 s הדרה דינמי. יוני בעלי מצבי חיוב של +1 ו-> 6 לא נכללו. בקרת רווח אוטומטי (AGC) היעד של 5.5 e5 שימש עם זמן הזרקה מקסימלית של 50 ms ו סף עוצמה של 5.5 e4. יוני שנבחרו לMS2 היו חשופים לפיצול של דיסוציאציה באנרגיה גבוהה יותר (HCD) באמצעות 32% אנרגיית התנגשות מנורמלת. יוני קטעים זוהו בספקטרומטר ה15,000 וברזולוציה של 5.0 e4 AGC. 7. ניתוח נתונים חיפוש קבצי MS טנדם עם תוכנת ניתוח מלמטה למעלה פרוטאומניקס נגד מסד הנתונים C. אלגיה . הגדר את פרמטרי החיפוש של ניתוח החלבון כהמשך: טריפסין אחד החמיץ מחשוף, 375 – 1500 m/z פפטיד טווח המסה, השבר סובלנות המסה של 0.02, ו עמידות המונית הקודמן של 10 דפים לדקה. Carbamidomלציה מוגדר כשינוי סטטי וכולם יודעים שינוי קיצוני הידרוקסיל שרשרת צד9,10 כדינאמי. זיהוי פפטיד נוצר ב 95% ביטחון (בינוני) ושאריות ב 99% ביטחון (גבוה). קצב גילוי השקר (רוזוולט) מוגדר 1%. ייצוא נתונים למסד נתונים אלקטרוני ולסכם את היקף החמצון לכל פפטיד או שאריות באמצעות המשוואה מתחת11:הערה: כאשר אזור EIC שונה הוא אזור כרומטוגרפי שחולצו (EIC) של פפטיד או שאריות עם שינוי חמצוני, ואזור EIC הוא האזור הכולל של פפטיד זהה או שאריות עם וללא שינוי חמצוני.