Ensaio opsono-adesão para avaliar anticorpos funcionais no desenvolvimento de vacinas contra bacillus anthracis e outros patógenos encapsulados

Reconhecimento, adesão, internalização e degradação de um patógeno são parte integrante da fagocitose¹, um caminho saliente na resposta imune inata hospedeira descrita pela primeira vez por Ilya Metchnikoff em 1883^2,3. Leucócitos fagocíticos, bem como outras células do sistema imunológico, são altamente discriminatórios em sua seleção de alvos; eles são capazes de distinguir entre “não-eu infeccioso” e “eu não infeccioso” através de padrões moleculares associados ao patógeno por seu repertório de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs)^4,5. O reconhecimento hospedeiro de um patógeno também pode ocorrer com a vinculação de opsoninas hospedeiras, como complemento e anticorpos⁶. Esse processo, chamado opsonização, reveste o patógeno com essas moléculas, aumentando a internalização ao vincular-se a receptores opsônicos (por exemplo, receptores complementares e fc) em células fagocíticas⁶. Para que um patógeno adere a um fagocito, é necessária a ligação coletiva de múltiplos receptores com seus ligantes cognatos. Só então a adesão pode desencadear e sustentar cascatas de sinalização dentro da célula hospedeira para iniciar a internalização⁶.

Devido à importância da fagocitose no despejo de patógenos e prevenção de infecções, patógenos extracelulares desenvolveram inúmeras formas de subverter esse processo para prolongar sua sobrevivência. Uma estratégia de importância é a produção de uma cápsula polimérica aniônica (por exemplo, polissacarídeo ou poliaminoácido), que é anti-fagocítica em virtude de sua carga, é pouco imunogênica e protege moléculas no envelope bacteriano das PRRs^6,7. Patógenos como Cryptococcus neoformans e Streptococcus pneumoniae possuem cápsulas compostas de polímeros sacarídeos, enquanto staphylococcus epidermidis e algumas espécies de Bacillus produzem ácido poli-ɣ-glutamico (PGGA)^7,8. No entanto, outros patógenos produzem cápsulas que se assemelham ao eu não infeccioso. Por exemplo, Streptococcus pyogenes e uma cepa patogênica de B. cereus têm uma cápsula de ácido hialurônico que não é apenas anti-fagocítica, mas que também pode não ser reconhecida como estrangeira pelo sistema imunológico^9,10.

A conjugação da cápsula para proteínas portadoras converte-os de antígenos pobres e independentes de T em antígenos altamente imunogênicos dependentes de T que podem induzir os anticorpos anti-cápsula de soro elevado^11,12. Esta estratégia é empregada para vacinas licenciadas contra S. pneumoniae, Haemophilus influenzaee meningite Neisseria¹¹. As atividades opsônicas de anticorpos anti-cápsula têm sido comumente avaliadas por ensaios de morte opsono-fagocítico (OPKA)^13,14,15,16. Estes ensaios testam se anticorpos funcionais podem desencadear fagocitose e matar¹⁴. No entanto, o uso de OPKA com patógenos infecciosos, como Agentes e Toxinas Biológicas de Nível 1 (BSAT), incluindo B. anthracis^17,é perigoso e apresenta riscos à segurança; esses ensaios exigem um manuseio extensivo de um agente selecionado. O manuseio de agentes selecionados só pode ser feito em laboratórios de biossegurança restrito nível 3 (BSL-3); o trabalho nessas áreas exige procedimentos operacionais prolongados devido às inúmeras precauções de segurança e segurança que devem ser seguidas. Os laboratórios BSL-3 também normalmente não são equipados com os equipamentos especializados utilizados para o trabalho opka, como microscópios e citómetros. Assim, desenvolvemos um ensaio alternativo baseado no uso de bactérias inativadas^18,19. Referimo-nos a isso como um ensaio opsono-adesão (OAA) que não depende da internalização e da morte como saídas de ensaio; em vez disso, a adesão de patógenos inativados opsonizados é usada como um índice de fagocitose. Mecanicamente, o OAA é um substituto adequado porque a adesão ocorre a priori e está intimamente entrelaçada com internalização e assassinato intracelular. Do ponto de vista da biossegurança, o OAA é preferido porque requer manuseio mínimo de um agente infeccioso, é experimentalmente de menor duração que o OPKA, e pode ser realizado em laboratórios BSL-2 depois que um estoque do patógeno inativado foi produzido e transferido.

Demonstramos a utilização da OAA para examinar a função opsônica de anticorpos anti-cápsula encontrados em soro de primatas não humanos (NHPs) vacinados com uma cápsula conjugada [ou seja, PGGA de B. antracracis conjugado ao complexo proteico da membrana externa (OMPC) de meningite neisseria]²⁰. Bacilos opssonizados de soro foram incubados com uma linha de células macrófagos de camundongos aderentes, RAW 264.7. Após a fixação, a monocamada celular e bacilos aderentes foram imagens por microscopia de fluorescência. A adesão bacteriana aumentou quando os bacilos foram incubados com soro de NHPs vacinados com o conjugado da cápsula em comparação com o soro de controle²⁰. Adesão correlacionada com a sobrevivência do desafio antraz^20,21. Assim, o uso de OAA caracterizou a função de anticorpos anti-cápsula e facilitou muito o teste do nosso candidato à vacina.