在这里,我们提供协议,在果蝇黑色素气仪中执行三个简单的伤害诱发的斧子退化(斧子死亡)测定,以评估被切断的斧子及其突触的形态和功能保存。
Axon退化是神经退行性疾病和神经系统受到机械或化学力挑战的共同特征。然而,我们对斧子退化背后的分子机制的理解仍然有限。伤害引起的斧子退化是一个简单的模型,用于研究断的斧子如何执行自己的拆卸(斧子死亡)。近年来,从苍蝇到哺乳动物,已发现一种进化保存的斧子死亡信号级联,这是分离的斧子在受伤后退化所必需的。相反,衰减的斧子死亡信号会导致被割断的斧子及其突触的形态和功能保存。在这里,我们提出了三个简单的和最近开发的协议,允许观察六核形态,或合六和突触功能被切断的断体和突触功能,从神经元细胞体被切断,在果蝇果蝇果蝇果蝇果蝇果蝇果蝇果蝇。形态学可以在机翼中观察到,其中部分损伤导致同一神经束中未受伤的控制斧头并排死亡。或者,在大脑中也可以观察到斧形形态,整个神经束会经历由天线消融引起的斧子死亡。分离的斧子及其突触的功能保存可以通过简单的光遗传学方法与突触后修饰行为相结合来评估。我们举例使用高线功能丧失突变和过度表达的dnmnat,两者都能够延迟斧子死亡数周至数月。重要的是,这些协议可以在伤害之外使用;它们有助于神经元维持因子、斧路迁移和同形线粒体的表征。
神经元的形态完整性对于整个生命中持续神经系统功能至关重要。绝大多数的神经元体积是由斧子11,22采取;因此,对神经系统来说,维持特别长的斧子是一个重大的生物和生物能量挑战。已确定多种共和体内和胶质外在支撑机制,确保终身共和生存。他们的损伤导致斧子退化3,这是神经系统在疾病中受到挑战的一个常见特征,并且受到机械或化学力44,5。5然而,安克逊退化的基本分子机制在任何情况下仍然难以理解,使得开发有效的治疗方法来阻止斧子损失具有挑战性。发展针对这些神经系统疾病的有效疗法很重要,因为它们给我们的社会造成了巨大的负担。
伤害引起的斧子退化是研究断体斧子如何进行自身拆卸的简单模型。瓦勒亚退化(WD)由奥古斯都·沃勒于1850年发现并命名,是一个总称,由两个不同的分子分离过程7组成。首先,在斧头损伤后,从细胞体分离的斧头在受伤后一天内通过进化保存的斧头死亡信号级联积极执行自己的自我毁灭(斧头死亡)。其次,周围的胶质和专门的邻形细胞在三到五天内接触和清除产生的斧屑。斧子死亡信号的衰减导致断的斧子,保持数周9,109,10,11,12,而胶质吞没的衰减最终在斧子碎片,持续数周在体内,11,1213,14,15。13,14,15
对苍蝇、老鼠、老鼠和斑马鱼的研究表明,阿克斯死亡信号信号发出信号的几种进化保存和基本中介。斧子死亡突变体含有分断的斧子和突触,这些斧子和突触没有经历斧子死亡;,在没有细胞体支撑,,,,9、10、12、13、16、17、18、19、20、21、22、2310,的情况下,它们在形态上和功能上保持了数周。,,1821,221323,20912161719这些中介的发现和表征导致了执行斧子死亡的分子通路的定义。重要的是,斧子死亡信号不仅被切开,粉碎或拉伸24,25,25激活;它似乎也是神经条件的不同动物模型(例如,斧子以与损伤无关的方式退化4,但具有一系列有益结果44,8)8的贡献者。因此,了解斧子死亡如何在受伤后执行斧子退化,可能会提供超越简单伤害模型的见解;它也可以提供治疗干预的目标。
果蝇果蝇果蝇黑色素虫(果蝇)已被证明是一个宝贵的系统,斧子死亡信号。研究揭示了四个基本进化保存的轴子死亡基因:高线(hiw)11,14,dnmnat12,26,dsarm1011,14和dsarm10dnmnat12,26axun死(轴)12。这些调子的修改——hiw、dsarm和斧头的功能丧失dsarm突变,以及dnmnat的过度表达——有力地阻止了苍蝇寿命的轴子死亡。虽然被切断的野生轴突在1天内死亡,但被切断的轴突及其缺乏hiw、dsarm或斧头的突触不仅停留在hiw形态学上,而且功能保存数周。能否通过高水平的dnmnat实现功能保存,仍有待确定。
在这里,我们将提出三种简单和最近开发的协议,以研究斧子死亡(例如,被切断的斧子的形态和功能及其突触随着时间的推移),在缺乏细胞身体支持。我们演示了衰减的斧子死亡如何导致被切断的斧子,这些斧子在形态上保存与hiw功能丧失突变(hiw_N),以及衰减的斧子死亡如何导致被切断的斧子和突触,这些斧子和突触在功能上保持至少7天,过度表达的dnmnat(dnmnat dnmnatOE)。这些协议允许在中枢或外周神经系统(分别为CNS和PNS)13、14,14中观察个体轴突和突触形态,而在CNS中,通过使用简单的光遗传学设置与修饰作为行为读出12相结合,可以可视化被切断轴子及其突触的功能保存。
这里描述的协议允许对形态的可靠和可重复的观察,以及斧子及其突触的功能,从德罗索菲拉的细胞体分离出来。机翼测定有助于在PNS14中并排观察未受伤的控制斧头的斧头死亡,而天线测定有助于观察GFP标记的斧子及其突触的整个神经束,以评估大脑(CNS)12的形态和功能。12在设计实验时,研究形态学的每种方法都有关键步骤和某些优势。
为了观察机翼PNS中的斧子形态,由于机翼的透明度,实验可以很容易地进行:它允许绕过解剖和免疫组织化学。然而,由于缺乏固定,机翼必须立即图像后,安装14。目前,两个不同的Gal4驱动程序经常使用,要么ok371Gal4或dpr1Gal4,并且两个参考提供了量化退化14,26,26的不同方法。推荐使用”具有可抑制细胞标记(MARCM)的马赛克分析“14,31,,31作为六角形态的分辨率是前所未有的,建议对几个神经元进行稀疏标记。相反,在翅膀上不可能观察到突触,它们位于苍蝇胸部内的腹神经线。此外,免疫组织化学无法想象额外的六核标记:蜡状角质使固定剂和抗体无法扩散到底层组织。
为了观察中枢神经系统中的斧子和突触形态,必须进行大脑解剖。它们提供了使用免疫作用化学来可视化额外的六核和突触标记的优点,在相同的视场10、13,13中,突触可以和斧头一起观察到。大量特征嗅觉受体神经元(ORN)Gal4驱动器是现成的32,而且经常,OR22aGal4是首选的驱动因素。对于天线消融,OR22a神经元的细胞体位于第3段(图2B)。荧光强度的定量用于量化斧子或突触13的退化。相反,由于脑解剖和抗体染色,实验非常耗时。
为了在轴突手术后可视化轴突和突触功能,光遗传学用于触发天线梳理:它用作分断轴子及其突触12的功能保存的读出。梳理电路和相应的感官,间和运动神经加尔4驱动器已被彻底描述29,30。29,GMR60E02Gal4标记约翰斯顿的器官 (JO) 感觉神经元的子集,这些神经元是培养29、30,30的所必需的和足够的。对于天线消融,JO神经元的细胞体位于第2天线段(图2B)。光遗传学设置可以很容易地从头开始构建,或者调整现有设置。重要的是,实验必须在黑暗的房间里进行,从而用红外 (IR) LED 聚光灯进行可视化飞行。当使用CsChrimson作为一个通道,这是至关重要的是提供食物的所有跨视网膜和红色LED聚光灯,以激活JO神经元29。或者,蓝色光敏通道和蓝色LED聚光灯,或TrpA1通道和温度可用于神经元激活29,33。29,梳理行为的量化已经描述12,29。12,
当这些测定用于专门研究斧子死亡时,重要的是要注意,形态学或功能保存的表型应该随着时间的推移而健壮。在有些情况下,斧子死亡导致形态保存34、35,35中一致但不太明显的表型,而且这种表型是否转化为功能保存仍有待确定。
在果蝇幼虫发育过程中,在神经元中也观察到了Axon死亡表型,其中神经被压碎,而不是受伤11,23。,23在这里,我们特别关注完成发育的成人果蝇神经元。在这种情况下,RNA干扰36,或组织特异性CRISPR/Cas937的使用可以很容易地实现。重要的是,上述技术可用于一个斧子死亡独立语境:它们促进神经元维持因子38的表征,斧路迁移39,年龄依赖的斧子线粒体变化40,和体量线粒体41的形态。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢整个Neukomm实验室的贡献。这项工作得到了瑞士国家科学基金会(SNSF)助理教授奖(176855年)、国际截瘫研究基金会(IRP、P180赠款)、SNSF Spark(190919年赠款)以及洛桑大学和洛桑大学和基础神经科学系(沃州)到LJN。
Tweezers (high precision, ultra fine) | EMS | 78520-5 | Antennal ablation |
MicroPoint Scissors (5-mm cutting edge) | EMS | 72933-04 | Wing injury |
1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086.0000 | |
35mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900 | |
Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific™ | BB02400600A113MNT0 | |
Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientific™ | AA00008032E00MNT10 | |
High-Sensitivity USB 2.0 CMOS Camera, 1280 x 1024, Global Shutter | Thorlabs | DCC1240M | Camera setup |
SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
25mm 1/1.2" C mount Lens | Tamron | M112FM25 | |
Adapter with External M27 x 0.5 Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs | SM1A36 | |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 700 nm | Thorlabs | FELH0700 | |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 1" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M10 | |
850 nm, 900 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M850L3 | IR LED spotlight |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 850 nm | Thorlabs | FELH0850 | |
SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
660 nm, 940 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M660L4 | Red LED spotlight |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube | Thorlabs | KPS101 | LED control |
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | Thorlabs | LEDD1B | |
150 mm x 300 mm x 12.7 mm Aluminum Breadboard, M6 Double-Density Taps | Thorlabs | MB1530/M | Mount base |
Ø12.7 mm Universal Post Holder, Spring-Loaded Locking Thumbscrew, L = 75 mm | Thorlabs | UPH75/M | Mount, 3x (IR LED, red LED, cam) |
Ø1.20" Slip Ring for SM1 Lens Tubes and C-Mount Extension Tubes, M4 Tap | Thorlabs | SM1RC/M | |
Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 150 mm | Thorlabs | TR150/M | |
Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 40 mm | Thorlabs | TR40/M | |
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 5 mm Hex | Thorlabs | RA90/M | |
M6 x 1.0 Stainless Steel Cap Screw, 16 mm Long, Pack of 25 | Thorlabs | SH6MS16 | screws for mount onto base |
USB-6001 14-Bit 20 kS/s Multifunction I/O and NI-DAQmx | National Instruments | 782604-01 | Red LED spotlight controller |
20k Ohm 1 Gang Linear Panel Mount Potentiometer | TT Electronics/BI | P230-2EC22BR20K | fintuner for indicator |
IR (860nm) emitter, 100 mA radial | Osram | 475-1365-ND | Red light indicator |
cable | – | – | Misc |
All-trans retinal | Sigma | R2625 | |
Ethanol absolute | Vwr | 20821.296 | |
Halocarbon Oil 27 | Sigma | H8773 | |
Mowiol | Merk | 81381 | |
Paraformaldehyde | Sigma | F8775 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493 | |
Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning Corp | 4019862 | |
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning Corp | 4019862 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Chicken anti-GFP antibodies | Rockland | 600-901-215 | Antibodies |
Goat Dylight anti-Chicken | Abcam | ab96947 | |
FM7a, B | BDSC | RRID:BDSC_785 | X chromosome |
FRT19A[hs-neo] | BDSC | RRID:BDSC_1709 | |
hiw[ΔN] | BDSC | RRID:BDSC_51637 | |
hs-FLP[12] | BDSC | RRID:BDSC_1929 | |
tub-Gal80[LL1] | BDSC | RRID:BDSC_5132 | |
w[1118] | BDSC | RRID:BDSC_3605 | |
20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus | BDSC | RRID:BDSC_55135 | 2nd chromosome |
5xUAS-Gal4[12B] | Kyoto | RRID:Kyoto_108492 | |
5xUAS-HA::dnmnat | BDSC | RRID:BDSC_39702 | |
5xUAS-mCD8::GFP[LL5] | BDSC | RRID:BDSC_5134 | |
ase-FLP[2d] | Freeman laboratory | Neukomm et al., 2014 (PNAS) | |
CyO | BDSC | RRID:BDSC_2555 | |
dpr1-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_25083 | |
OR22a-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_9952 | |
ey-FLP[6] | BDSC | RRID:BDSC_5577 | 3rd chromosome |
GMR60E02-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_39250 | |
TM3,Sb,e | BDSC | RRID:BDSC_3644 |