Klamidya trachomatis Floxed Kaset Allelic Exchange Mutagene tarafından Markerless Gen Deletion
Summary
Burada tanımlanan floksed kaset allelic değişim mutagenezi, FLAEM kullanarak Chlamydia trachomatis hedefli, markerless gen delemesi için bir yöntemdir.
Abstract
Klamidya trachomatis genetik olarak manipüle etmek tarihsel olarak zor olmuştur zorunlu bir hücre içi patojendir. C. trachomatis oluşturmak ve ayrıcalıklı bir hücre içi niş korumak için kullandığı mekanizmaları açıklığa kavuşturma kesin ilerleme genetik araçların eksikliği nedeniyle sınırlı olmuştur. Neyse ki, son zamanlarda genetik manipülasyon teknikleri birkaç yeni gelişmeler olmuştur. Bunlar arasında floresan bildirilen allelik değişim mutagenezinin (FRAEM) gelişimi bulunmaktadır. Bu yöntem, antibiyotik direnci ni kodlayan bir seçki kaseti ve yeşil floresan protein (GFP) ile birleştiğinde hedeflenen gen silme işlemine olanak sağlar. Polikistronik operoniçindeki genleri hedef alırken bu stratejiye güvenmek, akım üstü genler üzerindeki polar etkilerin potansiyeli nedeniyle karmaşık olabilir. Floxed kaset allelic değişim mutagenezi (FLAEM), burada açıklanan protokol, kaset kaynaklı polar etkileri hafifletmek için geliştirilmiştir. FLAEM, allelik değişim ile hedeflenen silme işleminden sonra seçim kasetini çıkarmak için Cre-loxP genom düzenlemesini kullanır. Ortaya çıkan suşlar, bir veya daha fazla kodlama dizisinin belirteçsiz gen silmelerini içerir. Bu teknik gen fonksiyonunun doğrudan değerlendirilmesini kolaylaştırır ve C. trachomatis genetik manipülasyon için araçların repertoire genişletir.
Introduction
Klamidya trachomatis bakteriyel cinsel yolla bulaşan hastalığın önde gelen nedenidir ve insan sağlığı için önemli bir yük temsil eder. 100 milyondan fazla insan her yıl C. trachomatis1ile enfekte. Kadınlarda enfeksiyonların yaklaşık % 70’i pelvik inflamatuar hastalık, ektopik gebelik ve/veya kısırlık gibi zararlı üreme sağlığı etkilerine rağmen asemptomatiktir. Hastalık sekeli doğrudan C. trachomatis enfeksiyonu2tarafından başlatılan immünopatoloji ile ilişkilidir. Etkili bir aşı henüz geliştirilmemiştir; bu nedenle, bakteriyel virülans faktörlerinin ve diğer bakteriyel gen ürünlerinin işlevini anlamak önemli ve acil bir araştırma sorusudur.
Hücre içi bakteriler olarak, konak hücre istilası, hücre içi replikasyon, singeny salınımı, ve konak immünolojik yanıtların kaçamak kritik süreçlerdir. C. trachomatis hücre içi gelişim için bir inklüzum olarak adlandırdığı parasitophorous membran bağlı vauol oluşturur. Dahil edilmesi ve diğer birçok kritik sürecin oluşturulması, efektör proteinlerin tip III salgı sistemi (T3SS)3ile salgılanması ile sağlanır. Bu gizli efektörlerin işlevlerini açıklamak C. trachomatisgenetik inatçılığı nedeniyle uzun yıllar sınırlı kaldı. E. coliaksine, birçok klasik klonlama teknikleri Klamidyaiçin geçerli değildir. Birkaç büyük sınırlamalar dönüşüm verimliliği, sacB gibi karşı seçim muhabirleri eksikliği ve plazmid bakım içerir. E. coli plazmidler genellikle çoğaltma ve uygun seçici basınç kaynağı ile süresiz olarak muhafaza edilebilirken, C. trachomatis plasmids l2 serovar içinde yerli pL2 plazmid bulunan bakım için ek sekiz açık okuma çerçeveleri(pgp1-8) gerektirir4.
Son yıllarda chlamydia eşsiz biyoloji karşılamak birden fazla genetik araçlar üretilmiştir, henüz hala sınırlamalar vardır5,6,7. Etil metansülfonat (EMS) tedavisi ile kimyasal mutagenez yanlış mutasyonlar ortaya çıkarabilir, ya da (daha az sıklıkta) nükleotit geçişleri saçma bir mutasyon verim için erken bir stop codon tanıtan neden olabilir8. Transposon ekleme gen bozulması için verimli, ancak Klamidya araştırma mevcut teknoloji zahmetli ve zaman alıcı9. Hem EMS tedavisi hem de transposon mutagenez teknikleri rastgele mutasyonlar oluşturur ve mutant suşları izole etmek için sıkı tarama yöntemleri gerektirir. Grup II intronlar (örneğin, TargeTron) yerleştirerek genleri bozmak için bir yöntem yönlendirilmiş mutagenezi sağlar; ancak, bu yöntem verimlilik ile sınırlıdır ve ekleme sitesi her zaman düzgün10tahmin edilmez.
Floresan bildirilen allelic değişim mutagenez (FRAEM) antibiyotik direnci ve floresan muhabiri11sağlayan bir seçim kaset ikime ile birleştiğinde hedeflenen gen silme için kullanılan bir stratejidir. Ancak FRAEM, özellikle poliksit operonlar içindeki genleri hedef alırken, kasetin indüklediği polar etkilerin akıntı genleri üzerindeki potansiyeli ile karmaşıktır. Floxed kaset allelic değişim mutagenez (FLAEM) daha önce FRAEM seçim kaseti 12 ile gözlenen kaset kaynaklı polar etkileri hafifletmek için geliştirilen yeni bir genetik yaklaşımdır12. FLAEM, seçim kasetini kaldırmak ve akış aşağı genlerin ekspresyonunu geri getirmek için Cre-loxP genom düzenlemesini kullanır. Antibiyotik direnci ve yeşil floresan protein (GFP) içeren seçim kaseti, yan loks p siteleri ile yeniden yapılandırılır. Bu loxP siteleri Cre rekombinaz varlığında yeniden birleşebilir ve genom13kaseteksizyonu ile sonuçlanabilir. Bu strateji silme için tmeA hedeflenirken kaset kaynaklı polar etkileri hafifletmek için gösterilmiştir12,14.
Hem FRAEM hem de FLAEM yöntemleri pgp6’nın indüklenebilir ekspresyonu ile koşullu olarak muhafaza edilebilen aynı intihar vektörü olan pSUmC 4.0’ı kullanır. Pgp6 ekspresyonu daha önce plazmid tutma için gerekli olduğu gösterilmiştir ve bu nedenle plazmid bakım kontrol etmek için kaldıraçlı11,15. C. trachomatis pgp6 ekspresyonu indüklemek için susuz tetrasiklin (aTc) ile desteklenen ortamda yetiştirilen zaman, vektör korunur. ATc yokluğunda, vektör kaybolur. Hedeflenen gen deleksiyonu, genin seçilim kaseti için allelik değişimi ile elde edilir. Hedeflenen genin 3 kb bölgesi doğrudan yukarı ve aşağı akım rekombinasyon için homoloji kollar olarak hizmet vermektedir. Bu kollar seçilim kasetini çevreleyen pSUmC 4.0 vektörüne klonlanır. Başarılı C. trachomatis dönüşümü ve rekombinasyon olayları floresan raporlama ile gözlenmektedir. Vektör omurgave gfp üzerinde mCherry ifadesi seçim kaset ivedikırmızı ve yeşil floresan eklemeler verim. ATc kültür medyasından çıkarıldıktan sonra, sadece yeşil eklemeler intihar vektörünün kaybı ve seçim kasetinin bakteri genomuna entegrasyonu ile başarılı rekombinasyon olaylarını gösterir.
FLAEM, Cre rekombinaz ifade eden vektör pSU-Cre’nin yeni oluşturulan mutant türüne dönüştürülmesi yoluyla FRAEM’in bir uzantısını temsil eder. Cre rekombinaz loxP siteleri arasında rekombinasyon ve seçim kaseteksizyonu kolaylaştırır. Rekombinasyon olayları floresan raporlama ile gösterilir. pSU-Cre vektörü mCherry’yikodlar; böylece, gfp-ifade içermeler kırmızı floresan eklenmesi ile başarılı dönüşüm gösterilir. LoxP sitelerinde Cre aracılı rekombinasyon ile kaset sonuçları için seçici basınç yokluğunda ekimi ve kaset kaybı kırmızı sadece eklemeler ile gösterilir. pSUmC-4.0’da olduğu gibi pGP6’nın indüklanabilir ifadesi pSU-Cre’yi koşullu olarak korumak için kullanılır. ATc ve antibiyotik seçimi çıkarıldıktan sonra, plazmid tedavi edilir, ve ortaya çıkan markerless silme zorlanma nonfloresan olduğunu. Bu yöntem, kasetkaynaklı polar etkiler sorununu ele adatır.
Protocol
Representative Results
Discussion
FLAEM tarafından C. trachomatis’de belirtilmeyen gen silmelerin üretimi için burada açıklanan protokol, gereksiz genlerin hedefli silinmesine izin verir ve kasetin neden olduğu polar etkileri ortadan kaldırır. Protokol, pSUmC 4.0 intihar vektörüne yerleştirilen 5′ ve 3′ homoloji kollarının dikkatli tasarımına, C. trachomatis’in etkin dönüşümüne ve izole mutant suşlarının dikkatli bir şekilde taranmasına dayanır. Bu yöntemle başarılı genom mühendisliği, floresan olmayan ve…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, NIAID (a1065530 ve Al124649 hibe) K.A. Fields Halk Sağlığı Servisi hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam–/dcm– Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
References
- World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, 207-208 (2012).
- Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
- Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
- Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239 (2009).
- Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
- Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
- Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
- LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343 (2019).
- Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989 (2013).
- Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817 (2016).
- Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).
- Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
- McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640 (2017).
- Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
- Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
- Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142 (2013).
- Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).
