클라미디아 트라코마티스의 플록세드 카세트 알레릭 교환 돌연변이에 의한 마커리스 유전자 결실
Summary
여기서 기재된 것은 플로시드 카세트 알레릭 교환 돌연변이, FLAEM을 사용하여 클라미디아 트라코마티스에서 표적화된, 마커리스 유전자 결실을 위한 방법이다.
Abstract
클라미디아 트라코마티스는 유전적으로 조작하기가 역사적으로 어려웠던 의무적인 세포내 병원체입니다. C. trachomatis가 특권있는 세포 내 틈새 시장을 만들고 유지하기 위해 사용하는 메커니즘을 해명하는 데 결정적인 진전이 유전 도구의 부족으로 인해 제한되었습니다. 다행히도, 최근에 유전 조작 기술에 있는 몇몇 새로운 어드밴스가 있었습니다. 이들 중형-보고된 말투교환 돌연변이 발생(FRAEM)의 개발이다. 이 방법은 항생제 내성 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 선택 카세트의 삽입과 결합된 표적 유전자 결실을 허용한다. 이 전략에 대한 의존은 다운스트림 유전자에 대한 극성 효과의 잠재력으로 인해 다각형 오페론 내의 유전자를 표적으로 할 때 복잡할 수 있습니다. 플록스 카세트 알레릭 교환 돌연변이 발생(FLAEM)은 여기에 설명되어 있는 프로토콜로, 카세트-유도극성 효과를 완화하도록 개발되었다. FLAEM은 Cre-loxP 게놈 편집을 사용하여 알레릭 교환에 의한 표적 결실 후 선택 카세트를 제거합니다. 생성된 균주는 하나 이상의 코딩 서열의 마커리스 유전자 삭제를 포함합니다. 이 기술은 유전자 기능의 직접적인 평가를 용이하게하고 C. trachomatis에 있는 유전 조작을 위한 공구의 레퍼토리를 확장합니다.
Introduction
클라미디아 트라코마티스는 세균성 성병의 주요 원인이며 인간의 건강에 상당한 부담을 나타냅니다. 매년 1억 명 이상이 C. 트라코마티스1에감염됩니다. 여자에 있는 감염의 대략 70%는 골반 선동적인 선동적인 질병, 자궁 외 임신 및/또는 불모와 같은 해로운 생식 건강 효력에도 불구하고 자각 증상이 없습니다. 질병 후유증은 C. trachomatis 감염에 의해 개시된 면역 병리학과 직접 관련이있습니다 2. 효과적인 백신은 아직 개발되지 않았습니다. 따라서, 세균성 독성 인자 및 기타 세균성 유전자 제품의 기능을 이해하는 것은 중요하고 긴급한 연구 질문입니다.
세포 내 박테리아로서, 숙주 세포 침략, 세포 내 복제, 자손의 방출, 및 숙주 면역 반응의 회피는 중요한 과정입니다. C. trachomatis는 세포 내 발달을 위한 포함이라고 불리는 parasitophorous 막 결합 환액을 형성합니다. 포함 및 다른 많은 중요한 과정의 확립은 타입 III 분비 시스템(T3SS)을 통해 이펙터 단백질의 분비에 의해 달성된다3. 이러한 분비 이펙터의 기능을 해명하는 것은 C. trachomatis의유전적 난치성으로 인해 수년 동안 제한되었습니다. 대장균과는 달리, 많은 고전적인 복제 기술은 클라미디아에적용되지 않습니다. 몇 가지 주요 제한 사항에는 변환 효율성, sacB와 같은 카운터셀렉션 리포터 부족 및 플라스미드 유지 관리가 포함됩니다. 대장균 플라스미드는 일반적으로 복제 및 적절한 선택적 압력의 기원으로 무기한 유지될 수 있는 반면, C. 트라코마티스 플라스미드는 L2 혈청바르4내의 기본 pL2 플라스미드에서 발견되는 유지관리를 위해 8개의 개방 판독프레임(pgp1-8)을 추가로 필요로 한다.
최근 몇 년 동안 클라미디아의 독특한 생물학을 수용 하는 여러 유전 도구 생성 되었습니다., 아직 제한5,6,7. 에틸 메탄설포네이트(EMS) 치료에 의한 화학적 돌연변이 발생은 잘못된 돌연변이를 유발할 수 있거나, 또는 (덜 빈번하게) 넌센스 돌연변이를 산출하기 위해 조기 정지 코동을 도입하는 뉴클레오티드 전이를 초래할 수있다 8. 트랜스포종 삽입은 유전자 파괴에 효율적이지만 클라미디아 연구의 현재 기술은 힘들고 시간이 많이 소요되는9. EMS 처리와 트랜스포종 돌연변이 유발 기술은 무작위 돌연변이를 생성하고 돌연변이 균주를 분리하기 위해 엄격한 스크리닝 방법을 필요로 합니다. 그룹 II 인트론 (예를 들어, TargeTron)의 삽입에 의해 유전자를 방해하는 방법은 지시 된 돌연변이 발생을 허용; 그러나, 이 방법은 효율에 의해 제한되고, 삽입 부위가 항상 제대로 예측되지 는않는다(10).
형광-보고된 말투교환 돌연변이발생(FRAEM)은 항생제 내성 및 형광리포터(11)를제공하는 선택 카세트의 삽입과 결합된 표적 유전자 결실에 사용되는 전략이다. 그러나, FRAEM은 특히 polycistronic 오페론 내의 유전자를 표적으로 할 때 다운스트림 유전자에 카세트 유도한 극성 효력의 잠재력에 의해 복잡합니다. 플록스 카세트 알레릭 교환 돌연변이 유발(FLAEM)은 이전에 FRAEM 선택카세트(12)와함께 관찰된 카세트 유도 극성 효과를 완화하기 위해 개발된 새로운 유전적 접근법이다. FLAEM은 Cre-loxP 게놈 편집을 사용하여 선택 카세트를 제거하고 다운스트림 유전자의 발현을 복원합니다. 항생제 내성 및 녹색 형광 단백질 (GFP)을 포함하는 선택 카세트는 측면 loxP 사이트로 재설계됩니다. 이들 loxP 부위는 Cre 재조합아제의 존재속에서 재결합하고게놈(13)으로부터카세트를 절제할 수 있다. 이러한 전략은 결실을 위한 tmeA를 타겟팅할 때 카세트 유도 극성 효과를 완화하는 것으로 나타났다12,14.
FRAEM 및 FLAEM 방법 모두 pgp6의 유도성 발현을 통해 조건부로 유지될 수 있는 동일한 자살 벡터, pSUmC 4.0을 이용한다. pgp6의 발현은 이전에 플라스미드 유지에 필요한 것으로 나타났으며 따라서 플라스미드 유지보수11,15를제어하는 데 활용된다. C. 트라코마티스가 pgp6 발현을 유도하기 위해 무수 테트라사이클린(aTc)으로 보충된 매체에서 성장하면, 벡터가 유지된다. aTc가 없으면 벡터가 손실됩니다. 표적 유전자 결실은 선택 카세트에 대한 유전자의 전부 교환을 통해 달성된다. 표적 유전자의 상류 및 하류에 직접 3kb 영역은 재결합을 위한 상동성 무기역할을 한다. 이들 암은 선택 카세트를 측면으로 pSUmC 4.0 벡터로 복제된다. 성공적인 C. trachomatis 변환 및 재조합 이벤트는 형광 보고를 통해 관찰됩니다. 선택 카세트 내의 벡터 백본 및 gfp 상에서mCherry의 발현은 적색 및 녹색 형광 개재물산출한다. aTc가 배양 배지에서 제거되면, 녹색 전용 개재는 자살 벡터의 손실과 성공적인 재결합 이벤트를 나타내고 선택 카세트를 박테리아 게놈으로 통합합니다.
FLAEM은 새로 생성된 돌연변이 균주 내로, Cre 재조합 발현 벡터, pSU-Cre의 후속 변환을 통해 FRAEM의 확장을 나타낸다. Cre 재조합은 loxP 부위와 선택 카세트의 절제 사이의 재결합을 용이하게 한다. 재결합 이벤트는 형광 보고를 통해 표시됩니다. pSU-Cre 벡터는 mCherry를인코딩합니다. 따라서, 성공적인 변환은 gfp-표현포함에 적색 형광의 추가에 의해 지시된다. 카세트에 대한 선택적 압력의 부재에서 재배는 loxP 부위에서 Cre 매개 재조합을 초래하고, 카세트의 손실은 적색 전용 포함물로 지시된다. pSUmC-4.0과 마찬가지로, pgp6의 유도성 발현은 pSU-Cre를 조건부로 유지하는 데 사용된다. aTc 및 항생제 선택이 제거되면 플라스미드가 경화되고 생성된 마커리스 결실 균주는 불형성입니다. 이 방법은 카세트로 유도된 극성 효과의 문제를 해결합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 FLAEM에 의한 C. 트라코마티스의 마커리스 유전자 결실의 생성을 위해 비필수 유전자의 표적 삭제를 허용하고 카세트 유도 극성 효과를 제거한다. 이 프로토콜은 pSUmC 4.0 자살 벡터에 삽입된 5′ 및 3′ 상동성 무기의 신중한 설계, C. 트라코마티스의 효율적인 변형 및 분리된 돌연변이 균주의 신중한 스크리닝에 의존합니다. 이 방법을 통해 성공적인 게놈 공학은…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 보건원, NIAID (보조금 A1065530 및 Al124649)에서 K.A. 필드에 공중 위생 서비스 보조금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam–/dcm– Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
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