Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis
Summary
Hier beschreven is een methode voor gerichte, markerless gen verwijdering in Chlamydia trachomatis met behulp van floxed cassette allelic uitwisseling mutagenese, FLAEM.
Abstract
Chlamydia trachomatis is een obligate intracellulaire ziekteverwekker die historisch moeilijk te manipuleren is geweest. Definitieve vooruitgang bij het verduidelijken van de mechanismen die C. trachomatis gebruiken om een bevoorrechte intracellulaire niche te creëren en te behouden, is beperkt door een gebrek aan genetische hulpmiddelen. Gelukkig zijn er onlangs verschillende nieuwe ontwikkelingen in genetische manipulatie technieken. Een daarvan is de ontwikkeling van fluorescentie-gerapporteerde allelic uitwisseling mutagenese (FRAEM). Deze methode maakt gerichte genverwijdering mogelijk in combinatie met het inbrengen van een selectiecassette die antibioticaresistentie en groen fluorescerend eiwit (GFP) inkaartbrengt. Vertrouwen op deze strategie kan ingewikkeld zijn bij het richten van genen binnen polycistronic operons vanwege het potentieel van polaire effecten op downstream genen. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), het protocol waarvoor hier wordt beschreven, werd ontwikkeld om cassette-geïnduceerde polaire effecten te verlichten. FLAEM maakt gebruik van Cre-loxP genoombewerking om de selectiecassette te verwijderen na gerichte verwijdering door allelic exchange. De resulterende stammen bevatten markerless gendeleties van een of meer coderingssequenties. Deze techniek vergemakkelijkt de directe beoordeling van de genfunctie en breidt het repertoire van instrumenten voor genetische manipulatie in C. trachomatis uit.
Introduction
Chlamydia trachomatis is de belangrijkste oorzaak van bacteriële seksueel overdraagbare aandoeningen en vormt een aanzienlijke last voor de menselijke gezondheid. Meer dan 100 miljoen mensen zijn elk jaar besmet met C. trachomatis1. Ongeveer 70% van de infecties bij vrouwen zijn asymptomatisch ondanks schadelijke reproductieve gezondheidseffecten, zoals bekkenontstekingsziekte, buitenbaarmoederlijke zwangerschap en/of onvruchtbaarheid. Ziekte sequela zijn direct gerelateerd aan immunopathologie geïnitieerd door C. trachomatis infectie2. Er moet nog een effectief vaccin worden ontwikkeld; daarom is het begrijpen van de functie van bacteriële virulentiefactoren en andere bacteriële genproducten een belangrijke en dringende onderzoeksvraag.
Als intracellulaire bacteriën zijn gastheercelinvasie, intracellulaire replicatie, het vrijkomen van nakomelingen en ontduiking van gastheerimmunologische reacties kritieke processen. C. trachomatis vormt een parasitophoreuze membraan gebonden vacuole, genoemd een opname, voor intracellulaire ontwikkeling. De totstandbrenging van de opneming en vele andere kritieke processen worden bereikt door afscheiding van effectorproteïnen via een type III secretiesysteem (T3SS)3. Het verduidelijken van de functies van deze uitgescheiden effectoren was beperkt voor vele jaren als gevolg van de genetische onmateerbaarheid van C. trachomatis. In tegenstelling tot E. colizijn veel klassieke kloontechnieken niet van toepassing op Chlamydia. Een paar grote beperkingen omvatten transformatie-efficiëntie, gebrek aan tegenselectie verslaggevers zoals SACB, en plasmid onderhoud. Terwijl E. coli plasmiden over het algemeen voor onbepaalde tijd kunnen worden gehandhaafd met een oorsprong van replicatie en passende selectieve druk, vereist C. trachomatis plasmids nog eens acht open leesframes(pgp1-8) voor onderhoud dat op de inheemse pL2 plasmid binnen de L2 serovar4wordt aangetroffen.
In de afgelopen jaren zijn er meerdere genetische instrumenten gegenereerd die geschikt zijn voor chlamydia’s unieke biologie, maar er zijn nog steeds beperkingen5,6,7. Chemische mutagenese door ethylmethaansulfonaat (EMS) behandeling kan brengen verkeerde mutaties, of (minder vaak) kan resulteren in nucleotide overgangen de invoering van een voortijdige stop codon om een onzin mutatie opleveren8. Transposon inbrengen is efficiënt voor genverstoring, maar de huidige technologie in Chlamydia onderzoek is moeizaam en tijdrovend9. Zowel EMS-behandeling als transposon mutagenesetechnieken genereren willekeurige mutaties en vereisen rigoureuze screeningsmethoden om gemuteerde stammen te isoleren. Een methode om genen te verstoren door het inbrengen van groep II-intronen (bijvoorbeeld TargeTron) maakt gerichte mutagenese mogelijk; deze methode wordt echter beperkt door efficiëntie en de invoegplaats wordt niet altijd goed voorspeld10.
Fluorescentie-gerapporteerde allelic exchange mutagenesis (FRAEM) is een strategie die wordt gebruikt voor gerichte genverwijdering in combinatie met het inbrengen van een selectiecassette die antibioticaresistentie en een fluorescentiereporter11biedt. Toch wordt FRAEM gecompliceerd door het potentieel van door cassettegeïnduceerde polaire effecten op downstream genen, vooral wanneer het zich richt op genen binnen polycistronic operonen. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM) is een nieuwe genetische benadering ontwikkeld om de cassette-geïnduceerde polaire effecten eerder waargenomen met de FRAEM selectie cassette12te verlichten . FLAEM maakt gebruik van Cre-loxP genoombewerking om de selectiecassette te verwijderen en de expressie van downstreamgenen te herstellen. De selectiecassette met antibioticaresistentie en groen fluorescerend eiwit (GFP) is opnieuw ontworpen met flankerende loxP-sites. Deze loxP-sites kunnen opnieuw combineren in aanwezigheid van Cre recombinase en resulteren in excisie van de cassette uit het genoom13. Deze strategie is aangetoond dat het verlichten van cassette geïnduceerde polaire effecten bij het richten tmeA voor schrapping12,14.
Zowel FRAEM en FLAEM methoden maken gebruik van dezelfde zelfmoord vector, pSUmC 4.0, die voorwaardelijk kan worden gehandhaafd door middel van onuitleidbare expressie van pgp6. Uiting van pgp6 is eerder aangetoond dat het noodzakelijk is voor plasmidretentie en wordt daarom ingezet om plasmid onderhoud te controleren11,15. Wanneer C. trachomatis wordt geteeld in de media aangevuld met anhydrous tetracycline (aTc) om pgp6 expressie te induceren, wordt de vector gehandhaafd. Bij afwezigheid van aTc gaat de vector verloren. Gerichte genverwijdering wordt bereikt door allelic uitwisseling van het gen voor de selectiecassette. De 3 kb-regio’s direct stroomopwaarts en stroomafwaarts van het beoogde gen dienen als homologiearmen voor recombinatie. Deze armen worden gekloond in de pSUmC 4.0 vector flankeren de selectie cassette. Succesvolle C. trachomatis transformatie en recombinatie gebeurtenissen worden waargenomen door middel van fluorescentie rapportage. Expressie van mCherry op de vector backbone en gfp binnen de selectie cassette opbrengst rode en groene fluorescerende insluitsels. Zodra aTc uit kweekmedia is verwijderd, wijzen green-only insluitsels op succesvolle recombinatiegebeurtenissen met het verlies van de zelfmoordvector en de integratie van de selectiecassette in het bacteriële genoom.
FLAEM vertegenwoordigt een uitbreiding van FRAEM via de daaropvolgende transformatie van een Cre recombinase-uitdrukkende vector, pSU-Cre, in de nieuw gecreëerde mutantenstam. Cre recombinase vergemakkelijkt de combinatie tussen loxP-sites en excisie van de selectiecassette. Recombinatie gebeurtenissen worden aangegeven via fluorescentie rapportage. De pSU-Cre vector codeert mCherry; succesvolle transformatie wordt dus aangegeven door toevoeging van rode fluorescentie aan gfp-uitdrukkendeinsluitsels. De teelt bij afwezigheid van selectieve druk voor de cassette resulteert in cre-gemedieerde recombinatie op de loxP-locaties, en het verlies van de cassette wordt aangegeven door rood-only insluitsels. Net als bij pSUmC-4.0 wordt onuitleidbare expressie van pgp6 gebruikt om pSU-Cre voorwaardelijk te onderhouden. Zodra aTc en antibiotica selectie zijn verwijderd, de plasmid is genezen, en de resulterende markerless deletie stam is niet fluorescerend. Deze methode pakt het probleem van cassette-geïnduceerde polaire effecten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol voor de generatie markerless gendeleties in C. trachomatis door FLAEM maakt gerichte verwijdering van niet-essentiële genen mogelijk en elimineert door cassette-geïnduceerde polaire effecten. Het protocol is gebaseerd op een zorgvuldig ontwerp van 5′ en 3′ homologie armen ingevoegd in de pSUmC 4.0 zelfmoord vector, efficiënte transformatie van C. trachomatis, en zorgvuldige screening van geïsoleerde mutant stammen. Succesvolle genoomengineering via deze methode resulteer…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de GGD van het National Institute of Health, NIAID (subsidies A1065530 en Al124649), aan K.A. Fields.
Materials
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam–/dcm– Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
References
- World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, 207-208 (2012).
- Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
- Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
- Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239 (2009).
- Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
- Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
- Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
- LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343 (2019).
- Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989 (2013).
- Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817 (2016).
- Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).
- Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
- McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640 (2017).
- Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
- Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
- Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142 (2013).
- Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).
