Эффективная дифференциация постгонглионических симпатических нейронов с использованием человеческих плюрипотентных стволовых клеток в соответствии с безкормовыми и химически определенными условиями культуры

Постганглионические симпатические нейроны (симны) принадлежат к вегетативной нервной системе (ANS) и играют несколько важных ролей в реагировании и регулировании гомеостаза тела, независимого от сознания. Например, стресс стимулирует симны и вызывает ответ на борьбу или полет, что приводит к увеличению частоты сердечных приступов, артериального давления и потоотделения. Символы страдают от множественных расстройств человека из-за генетики, токсичности / травмы, или в качестве компаньонов к другим заболеваниям. Примером генетической невропатии является детское расстройство семейной дисавтотомии (FD), где тяжелая дисрегуляция симн вызывает дистостентомический кризис, очевидный потливость, пятно кожи, рвота приступы, гипертония, и тревога¹. Примером токсичности является химиотерапия, которая, как сообщается, имеют токсические побочные эффекты на вегетативные нейроны². Известно, что вегетативная денервация и гипериннервация могут привести к или сопровождать такие заболевания, как болезнь Паркинсона или гипертоническая почечная болезнь^3,4. Таким образом, возможность проводить исследования и понимать механизмы симН биологии и дефектов в контексте болезни полезно для поиска новых и эффективных методов лечения.

Анатомии
Периферическая нервная система ветвится в сенсорные и вегетативные деления. Афферентные нервы сенсорной нервной системы отвечают за ощущение боли и прикосновения, в то время как ANS отвечает за передачу информации из всех органов в мозг. АНС делится на кишечную нервную систему, иннерватирующую желудочно-кишечный тракт, парасимпатическую нервную систему, что важно для расслабления, и симпатическую нервную систему (СНС), что важно для активации/регулирования органов. SNS адаптирует двухнейронную систему^5. Преганглионические симпатические нейронные аксоны в спинном мозге сначала проект симпатической ганглиев, где postganglionic симН клеточные тела расположены. Эти нейроны затем отправить длинные прогнозы для innervate целевых тканей каждого органа в организме. Сигналы, передаваемые преганглионическими нейронами, являются холинергическими, в то время как постганглионические симнявляются являются адренергическими и, таким образом, выражают норадреналин (NE) в качестве основного нейромедиатора. Есть несколько заметных исключений постгонглионических, симпатических нейронов, которые холинергических, в том числе те, иннервируя кровеносные сосуды. Adrenergic postganglionic нейроны выражают ферменты тирозин гидроксилаза (TH), ароматические L-аминокислоты декарбоксилаза (AAAD), допамина – гидроксилаза (DBH), и моноамин оксидаза (МАО-А), все отвечает за генерацию и метаболизацию NE. Кроме того, они выражают NE рециркуляции транспортеров и / или рецепторов – adrenergic рецепторов (ADRA2), к-адренергический рецептор (ADR2B), норадреналин транспортер (NET1), и везикулярный моноамин транспортер (VMAT1/2).

Развития
Во время эмбрионального развития симны являются производными от нервного гребня (NC), который возникает между нервной трубки и наложения эктодерм⁶, и может дифференцировать в нескольких клеточных линий, в том числе меланоцитов, остеобластов, адипоцитов, глия, энтерические нейроны, сенсорные нейроны, и вегетативые нейроны⁷. Нейронные клетки гребня (NCCs) высоки мигрирующие клетки которые принимают несколько путей через зародыш. На этой ранней стадии развития NC, клетки выражают маркеры SNAIL1’2, FOXD3, и SOX10^8,,9,,10,11. Маршрут миграции вместе с их осевым местоположением определяет подтип NC, в который они будут развиваться. Эти подтипы NC можно отличить по их специфической экспрессии генов HOX: крякные NCCs не выражают гены HOX, неисправные NCCs выражают HOX 1-5, хоботные NCCs выражают HOX 6-9, и сакральные NCCs выражают HOX 10-11^12. Среди них магистральные НКК признаны основным источником симнов. Предшественники SymN выражают транскрипционный фактор MASH1/ASCL1¹³, который способствует выражению PHOX2B¹⁴ и INSM1¹⁵. Семейство транскрипционных факторов GATA выражается во время позднего сочувственного развития. GATA2 и GATA3 выражены в симнях, которые, в свою очередь, активируют DBH^16. Коэффициент транскрипции HAND2 также важен для выражения и поддержания DBH и TH^17.

HPSCs (например, эмбриональные и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки) являются мощным инструментом¹⁸ для повторения парадигм развития и создания симнов, которые затем могут быть использованы для моделирования заболеваний различных человеческих расстройств. Таким образом, создавая симнизмы из HPSC, крайне важно следовать руководящим принципам развития и оценивать выражение соответствующих маркеров в процессе дифференциации.

Предыдущий протокол symN
Немногие исследовательские группы ранее сообщали о генерации симнов из hPSCs^19,,20,,21. Прямое сравнение этих протоколов друг с другом и нашими был рассмотрен недавно²². В 2016 году²³, мы опубликовали протокол дифференциации для поколения вегетативных нейронов с символом symN(рисунок 1A). В этом протоколе использовалась среда на основе КСР, которая использовалась как в поддержании недифференцированных hPSCs, так и в дифференциации клеток. Кроме того, hPSCs были сохранены на мыши эмбриональных фибробластов (MEF фибробластов). Мы использовали этот протокол и PSCs от пациентов с FD для моделирования расстройства²³. В 2019 году мы описали более подробную версию этого старого^{протокола 24}. Таким образом, нервная судьба была вызвана двойным ингибированием SMAD^25, чтобы блокировать TGF-я и BMP сигнализации в первые 2 дня. Активация WNT с использованием CHIR99021 способствовала нейронных прародителей, чтобы стать nc-клетками. На 11-й день, клетки были отсортированы FACS для CD49D⁺ или SOX10^– популяций^26,23, что дало около 40% NC эффективности генерации. Таким образом, сортировка была необходима для обеспечения эффективности и чистоты для следующих шагов дифференциации. NCCs были сохранены и усилены как сфероиды с комбинированным лечением FGF2 и CHIR. После 4 дней, NC сфероидов обслуживания были покрыты и с учетом BDNF, GDNF, и NGF, чтобы закончить созревание symN. Хотя эти символы выразили сильные символы, такие как ASCL1, TH, DBH и PHOX2A, маркеры для более зрелых симнов, включая выражение никотинового ацетилхолина (CHRNA3/CHRNB4) и везикальный транспортер (VMAT1/2), были низкими даже после 70 дней дифференциации. Гены HOX в этом протоколе не были официально протестированы, а зрелые нервные свойства, включая электрофизиологическую активность клеток, не были проверены.

Здесь мы представляем оптимизированный протокол для генерации симнов(рисунок 1B). HPSCs поддерживаются в условиях фидер-бесплатно, на витронектин (VTN) покрытием блюда, используя Основные 8 (E8) СМИ²⁷. Формула дифференциации средств массовой информации была изменена на каждом этапе, тем самым увеличивая процент населения NC²⁸. Созревание symN может быть выполнено на⁺CD49D /SOX10^– отсортированных или несортированных популяциях NCC. Оба показывают высокий уровень выражения маркера symN к 30-му дню. Кроме того, симны, генерируемые с помощью этого протокола, реагируют на электрофизиологическую запись и на лечение симН-активатором и ингибиторными соединениями.