면역형광 현미경을 사용하여 파라핀 내장 펠린 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩의 식별
Summary
우리는 열 유도 항원 회수 및 이중 면역 표지 프로토콜을 사용하여 포름알데히드 고정 및 파라핀 내장 고양이 심원 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩 (NETs)을 식별하는 방법을 설명합니다.
Abstract
무세포 DNA(cfDNA)와 히스톤 및 호중구 엘라스타아제(NE)와 같은 단백질로 구성된 호중구 세포외 트랩(NETs)은 전신 염증이나 병원체에 반응하여 호중구에 의해 방출됩니다. NET는 이전에 인간과 개에서 혈전 형성을 증가시키고 섬유소 용해를 억제하는 것으로 나타났지만, 비대성 심근증에 이차적인 생명을 위협하는 합병증인 심인성 동맥 혈전색전증 (CATE)을 가진 고양이의 NET의 역할 을 참조하십시오. 고양이의 심인성 동맥 혈전에서 NET를 식별하고 정량화하는 표준화된 방법은 CATE에서의 병리학적 역할에 대한 이해를 증진시킬 것입니다. 여기에서, 우리는 포름알데히드 고정 및 파라핀 내장 혈전에서 NET를 식별하는 기술을 설명합니다 대동맥 분기 내에서, 부검 중에 추출. 자일렌으로 탈파화 한 후, 대동맥 절은 간접 열 유발 항원 검색을 시행했다. 단면도는 그 때, 투과되고, ex vivo NETs는 면역형광 현미경 검사법을 사용하여 무세포 DNA (cfDNA), 시트룰린화된 히스톤 H3(citH3), 및 호중구 엘라스타제(NE)의 공동 국소화에 의해 확인되었다. 혈전에서 NET의 면역 검출을 최적화하기 위해, 조직 원소의 자가형광은 현미경 검사법 전에 자가형광 담금질 과정을 사용하여 제한되었다. 이 기술은 그밖 종에 있는 NETs 그리고 혈전증을 공부하는 유용한 공구일 수 있고 이 복잡한 조건의 병리생리학에 새로운 통찰력을 제안합니다.
Introduction
비대성 심근병증을 가진 고양이는 생명을 위협하는 혈전색전성 합병증1,,2의위험이 있습니다. 고양이 심인성 동맥 혈전 색전증 (CATE)과 관련된 높은 사망률및 사망률에도 불구하고 고양이의 CATE의 근본적인 병리학은 제대로 이해되지 않습니다. 이 치명적인 상태의 위험에 고양이를 치료하고 식별하는 제한된 진단 및 치료 도구도 있습니다3.
선천성 면역에 있는 그것의 역할 이외에, 호중구는 호중구 세포 외 트랩 (NETs)를 풀어 놓음으로써 혈전증에 있는 역할을 하기 위하여 보였습니다, 이는 호중구 엘라스타제 (NE) 및 골수로파소와 같은 히스톤과 과립 단백질로 둘러싸인 무세포 DNA (cfDNA)의 웹 같은 네트워크인. 호중구는 전신 염증, 병원균과의 직접적인 만남 및 활성화 된 혈소판과의 상호 작용에 대한 응답으로 NETs 형성을 겪습니다4,,5,6,,7. 개에서 호중구 유래 DNA는 응고 용해를 억제하는 것으로 나타났으며 NET 단백질은 혈전 형성을 가속화합니다. 순환 세포 및 응고 성분을 트랩하는 NET의 능력은 또한 혈전 특성8,,9,10,,11,,12의핵심입니다.,
NET는 세포외 호중구 단백질, 히스톤 및 cfDNA의 동국화에 의해 검출됩니다. 이 때문에, 탈파라핀화된 조직의 면역형광에 의한 고정된 조직에서 의한 NET의 식별 및 정량화는 밝은 필드 현미경 을 사용하여 기존의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 얼룩보다 우수하다4,,5. 면역형광 현미경을 이용한 여러 인간 연구는 관상동맥 혈전, 대뇌 뇌졸중 혈전, 아테로스롬보증 및 정맥혈전13,,14,,15,,16,,17의구조적 성분으로 NETs를 확인하였다. 현재까지, 고양이 혈전에서 NET를 검출하고 정량화하는 표준화된 방법은 기술되지 않았다. 고양이 심인성 동맥 혈전에서 NET를 식별하면 NET및 혈전증의 향후 번역 연구를 촉진 할 수 있기 때문에, 우리는 고양이의 파라핀 내장 동맥 혈전에서 NET 식별 및 평가의 기술을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 이중 면역 표지 프로토콜 및 면역 형광 현미경 검사법을 사용하여 고정 된 고양이 심인성 동맥 혈전에서 NET를 식별하는 프로토콜을 설명합니다. 비록 심인성 동맥 혈전만 얼룩이 있었지만, 이론적으로이 프로토콜은 다른 유형의 트롬비와 다른 수의종에 사용될 수 있습니다. 고양이 동맥 혈전 내의 NET를 식별하는 것은 NET가 고양이의 혈전증에 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구 결과는 캘리포니아 대학, 데이비스, 반려동물 건강을 위한 센터 (CCAH 2018-30-F)에서 기금에 의해 지원되었습니다. 저자는 형광 현미경의 사용에 대한 케빈 울라드 박사를 인정하고 싶습니다.
Materials
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
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